核酸適配子在生化檢測中的應(yīng)用及基因突變位點(diǎn)識別新方法研究.pdf

1、核酸適配子(核酸適體，Aptamer)是人工合成的核酸序列，能以高的親合力同各種靶分子(小分子、蛋白質(zhì)，甚至整個細(xì)胞)特異性結(jié)合。它們是從含大量自由序列的核酸文庫中通過體外篩選分離出來的。含有富guanine(G)—片段的某些核酸適配子，例如，具有生物活性的抗增生性、抗艾滋病與抗血凝固的核酸適配子[1]，能夠通過氫鍵作用組成四元G平面，這種四元G平面能彼此重疊堆積，形成G—四股螺旋。這種四股螺旋能使核酸適配子具有特定的活性。某些物質(zhì)分子

2、就是通過與G—四股螺旋的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)它們治療與調(diào)節(jié)基因功能活性的作用[2]。在生化分析領(lǐng)域，由于核酸適配子，包括富G—核酸序列，具有高的目標(biāo)結(jié)合特異性與強(qiáng)的親和作用力，生物活性穩(wěn)定而易于保存，在活體組織中能快速滲透，而且易于合成，已經(jīng)被視為一種富有應(yīng)用潛力的探針，與抗體相媲美。目前，核酸適配子已經(jīng)被應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)的構(gòu)建中，為免疫檢測方法與免疫傳感器的研究提供了一個新的平臺[3]。盡管如此，相對于傳統(tǒng)的抗體技術(shù)，核酸適配子的

3、研究尚處于起始階段[4]。在用核酸適配子構(gòu)建靶物質(zhì)檢測體系的過程中，關(guān)鍵的一步是將靶物質(zhì)分子與核酸適配子的結(jié)合作用成功地轉(zhuǎn)換成可檢測的響應(yīng)信號。 單核苷多形態(tài)(SNPs)是指基因組中特定位置的堿基發(fā)生突變的現(xiàn)象，是遺傳變異中一種最為普遍的形式。由于氨基酸的替代、基因表達(dá)的更改與基因拼接的變化，SNP能夠影響基因組的功能，進(jìn)而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生與藥物代謝的個體差異[5]。雖然目前用于基因突變檢測的方法已有不少報(bào)道，多數(shù)體系需要對

4、目標(biāo)序列進(jìn)行放大，比如，PCR放大。為了靈敏、準(zhǔn)確、快速而低消耗地識別突變位點(diǎn)，需要繼續(xù)發(fā)展一些較為通用的檢測方法[6]。 基于以上考慮，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，本論文利用普通序列與富G—序列(這種序列可以形成分子內(nèi)或者分子間四股螺旋結(jié)構(gòu))核酸適配子發(fā)展了一序列的生物檢測體系，研究了富G—DNA衍生納米顆粒的團(tuán)聚行為：此外，利用核苷酸雜交作用發(fā)展了DNA序列檢測與點(diǎn)突變識別的新型電化學(xué)與光學(xué)生物傳感技術(shù)。具體細(xì)節(jié)如下： 1．基

5、于核酸適配子的生物檢測體系 A)富G—DNA衍生納米金的團(tuán)聚行為與基于G—四股螺旋結(jié)構(gòu)的電化學(xué)傳感器。 基于核酸適配子構(gòu)型轉(zhuǎn)換，利用腺苷做目標(biāo)分析物，第2章構(gòu)建了可再生、電化學(xué)傳感平臺，用于小分子物質(zhì)的靈敏檢測。首先在金電極表面修飾酪胺聚合膜和納米金層，再通過硫—金鍵的強(qiáng)親合力將巰基衍生的固定探針組裝在電極表面；特異性識別腺苷的二茂鐵—適配子探針與固定探針雜交后即完成傳感器的制備。腺苷的存在使二茂鐵標(biāo)記的適配子探針

6、從電極表面脫落而導(dǎo)致氧化還原峰電流下降。峰電流的降低幅度與腺苷含量成正比。此傳感界面可提供較寬的線性響應(yīng)范圍和較低的檢測下限，此外，還具有較高的選擇性、良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及再生性等優(yōu)點(diǎn)?；厥赵囼?yàn)證實(shí)了此電化學(xué)傳感系統(tǒng)用于腺苷檢測的可行性。 第3章考察了末端堿基為四個鳥嘌呤、含27個堿基的DNA序列修飾的金納米顆粒的團(tuán)聚行為。研究發(fā)現(xiàn)，某種程度上，納米顆粒間的G—四股螺旋促進(jìn)了納米金的團(tuán)聚。另一方面，金屬離子絡(luò)合的現(xiàn)象發(fā)生部分

7、鈍化：富G—DNA衍生納米顆粒的穩(wěn)定性比普通DNA衍生納米顆粒稍低；衍生納米顆粒團(tuán)聚過程中的金屬選擇性被有效抑制。據(jù)此，本章提出了富G—DNA衍生納米顆粒可能的團(tuán)聚機(jī)理。 基于富G—DNA的構(gòu)型轉(zhuǎn)換，第4章構(gòu)建了開/關(guān)型納米電子器件。巰基化、氨基修飾的富G—DNA固定于金電極表面，然后標(biāo)記電化學(xué)活性物質(zhì)二茂鐵(Fc)。表面限定的DNA序列能夠在剛性四元G—四股螺旋與彈性單鏈結(jié)構(gòu)間相互轉(zhuǎn)換。這種較大的形態(tài)改變使得DNA序列能夠象

8、尺蠖一樣做伸—縮運(yùn)動，產(chǎn)生了電流變化。因鉀離子能夠與G—四股螺旋發(fā)生特異性結(jié)合，使用這種無試劑的電化學(xué)傳感界面，不需任何額外的檢測試劑，就可實(shí)現(xiàn)對鉀離子的簡便、快速、選擇性檢測。 第5章利用分子間的G—四股螺旋結(jié)構(gòu)，不需任何信號增強(qiáng)試劑，構(gòu)建了高靈敏的電化學(xué)DNA生物傳感器。為了獲得傳感界面，通過巰—金鍵作用將捕獲探針(巰基DNA序列)組裝到金電極表面；用具有電化學(xué)活性的二茂鐵分子衍生末端富G—片段的DNA序列，作為信號報(bào)道探

9、針，這條探針設(shè)計(jì)成能夠形成分子間的四股螺旋，且與捕獲探針序列相匹配。信號探針與表面限定捕獲探針的雜交能使電極產(chǎn)生氧化還原峰電流。少量的目標(biāo)DNA與捕獲探針的預(yù)先雜交能夠使電極的峰電流發(fā)生顯著變化，產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)信號。用這種競爭雜交型的電化學(xué)檢測方法，獲得的濃度響應(yīng)范圍為9.92×10—14到9.92×10—10 M，檢測限為2.48×10—19 mol。相對于普通序列探針構(gòu)建的傳感界面，該傳感界面具有較高的靈敏度。此外，本檢測體系操作簡

10、便、快速、消耗低，而且回避了信號擴(kuò)大過程中可能產(chǎn)生的各種問題。 B)為了進(jìn)一步說明核酸適配子在生化分析中的優(yōu)越性，本部分內(nèi)容以IgE為待測目標(biāo)物質(zhì)、核酸適配子為識別探針，構(gòu)建了生物檢測體系，考察了核酸適配子檢測體系的分析性能。 在第6章，以含抗—IgE適配子標(biāo)準(zhǔn)序列片段、能形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的核酸分子為識別探針，構(gòu)建了IgE的電化學(xué)檢測平臺。沒有目標(biāo)IgE時，由于雙臂末端的雜交作用，電極表面限定的核酸適配子可以形成大的

11、發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，溶液中的電化學(xué)活性分子能產(chǎn)生氧化還原峰電流；有待測物質(zhì)IgE時，目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合不但能使電極表面介電層增厚，而且導(dǎo)致核酸適配子形態(tài)發(fā)生較大的改變：發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開將生物分子層與溶液的界面推離電極表面，電子傳遞距離增大，傳遞效率被有效抑制，產(chǎn)生增強(qiáng)的檢測信號。 基于核酸適配子對IgE的特異性識別作用，并借助短序列雜交反應(yīng)，第7章提出了IgE熒光增強(qiáng)均相檢測體系。用與核酸適配子匹配的德克薩斯紅標(biāo)記的DNA(T-DNA)作

12、為信號探針，在形成IgE/aptamer/T-DNA的三元復(fù)合物后，其熒光明顯增強(qiáng)：以4’-(4’-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(DABCYL，猝滅基團(tuán))標(biāo)記的另一條DNA(Q-DNA)為猝滅探針，這條DNA序列能與核酸適配子序列中同信號探針相鄰的另一片段發(fā)生雜交反應(yīng)，由于猝滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移而有效降低熒光背景。用這種方法檢測IgE取得的動力學(xué)響應(yīng)濃度范圍為9.2×10(-11)到3.7×10(-8)M，檢測限為5.7×10(

13、-11)M． 2．DNA雜交檢測與單核苷多形態(tài)識別方法研究 通過反轉(zhuǎn)分子信標(biāo)與DNA連接酶的聯(lián)合使用，第8章提出了一種DNA檢測與點(diǎn)突變識別的新策略。用5’端磷酸化、3’端修飾二茂鐵的DNA為信號探針，這條探針在目標(biāo)序列與連接酶存在時能被連接到表面限定的捕獲探針上，產(chǎn)生氧化還原電流；洗脫目標(biāo)DNA后，連接生成物可以形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，電流響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)一步增大。利用這種檢測方法，在3.4×10(-12)到1.4×10(-7)

14、M濃度范圍內(nèi)的目標(biāo)DNA序列能被定量檢測，檢測限為1.0×10(-12) M。 以納米金作為DNA捕獲探針的富集基體和檢測探針的熒光猝滅劑，第9章研究了一種新型的熒光淬滅DNA雜交均相檢測系統(tǒng)。以5’端修飾納米金的DNA作為捕獲探針，3’端修飾羧基四甲基羅丹名(TAMRA)的DNA作為信號探針，溶液中加入匹配DNA后，由于雜交反應(yīng)，TAMRA接近納米金表面而發(fā)生熒光淬滅；熒光淬滅效率隨著目標(biāo)DNA濃度的增大而增強(qiáng)，因此適合于D