結(jié)直腸癌血管生成三維模型的構(gòu)建及靶向干預(yù)研究.pdf

1、第一部分:結(jié)直腸癌血管生成體外三維模型的構(gòu)建 腫瘤內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的形成是結(jié)直腸癌進展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的關(guān)鍵。血管生成模型對早期篩選抗血管生成藥物和研究血管生成機制意義重大，但是，常規(guī)由血管生成因子刺激引起Matrigel或基質(zhì)膠原管道形成的傳統(tǒng)模型，無法說明體內(nèi)腫瘤血管形成的本質(zhì)，即內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞間的相互作用。本研究旨在構(gòu)建一個新的體外腫瘤血管生成模型，新模型的基礎(chǔ)是人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和結(jié)直腸癌LoVo細胞系的三

2、維共培養(yǎng)系統(tǒng)，特點是能體現(xiàn)內(nèi)皮和腫瘤細胞間的相互關(guān)系。首先將HUVEC和LoVo細胞導入三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，在體外形成腫瘤結(jié)構(gòu)樣的毛細血管。在該系統(tǒng)中不添加任何促血管生成因子，血管生成本能地依賴于腫瘤細胞的促血管生成；同時，在該系統(tǒng)中，還研究了血管生成的一些基本特征，包括細胞的增殖分化、趨化性、侵襲性和管道形成。結(jié)果顯示，與普通的正常內(nèi)皮細胞培養(yǎng)相比，三維共培養(yǎng)中的HUVEC模擬了腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特征表型，在LoVo細胞的刺激下顯示高度的

3、增殖分化、趨化、侵襲能力，在顯微鏡下可見共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞形成類毛細血管樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有腫瘤血管的異型性和多樣性，諸如三維血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不均一和管壁連續(xù)性中斷等。因此，三維共培養(yǎng)模型完整模擬了體內(nèi)腫瘤血管生成的過程，該模型的建立為后續(xù)的血管生成干預(yù)和抗血管生成藥物的篩選提供了一個更接近體內(nèi)真實狀態(tài)的研究平臺。 第二部分:低濃度泰素帝靶向干預(yù)結(jié)直腸癌血管生成的體內(nèi)體外研究 研究血管生成的促進和抑制因子需依賴體內(nèi)、體外的模型作

4、為療效指示劑，但是，常規(guī)的Matrigel血管生成分析不能反應(yīng)內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞間的相互關(guān)系。我們在上一部分已經(jīng)構(gòu)建了一個新的腫瘤血管生成模型，但該模型能否準確反映體內(nèi)腫瘤血管生成抑制劑的作用需要進一步檢測。在動物實驗中，低劑量的泰素帝具有抑制腫瘤血管生成和延緩腫瘤生長的作用，但其對內(nèi)皮細胞的功能和血管生成的影響知之甚少，特別是其對結(jié)直腸癌血管生成的影響尚未見報道。本部分的研究目的是體內(nèi)、體外評估低濃度的泰素帝對結(jié)直腸癌血管生成過程的靶

5、向干預(yù)。我們以構(gòu)建成功的三維共培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)，在體外檢測了低濃度泰素帝對內(nèi)皮細胞功能和管道形成能力的影響，探討其可能的作用機制，同時，使用荷人結(jié)直腸癌裸鼠移植模型評價低劑量泰素帝的體內(nèi)抗血管生成和抑瘤效應(yīng)，通過免疫組織化學方法測量毛細血管密度(MVD)、Hoechst染色檢測凋亡和99mTc-HL91顯像判斷腫瘤局部缺氧情況。結(jié)果顯示體外低濃度的泰素帝對HUVEC的各項功能均有影響，細胞的增殖分化、趨化和侵襲能力均受到不同程度的抑制，E

6、C細胞間的相互接觸聯(lián)系和管道形成能力基本消失。體內(nèi)低劑量泰素帝作用后的瘤體積抑制率和瘤重抑制率分別是23.6％和22.7％，99mTc-HL91顯像15分鐘后顯示低劑量泰素帝作用后乏氧性增加(P＜0.05)和峰值后移。低劑量泰素帝治療組瘤組織中MVD為31.5±2.0明顯少于對照組(60.3±2.1)(P＜0.01)，但腫瘤細胞的凋亡無明顯差別；最后我們得出結(jié)論：低濃度泰素帝是一個有廣闊應(yīng)用前景的特異性血管生成抑制劑，其作用機理與抑制內(nèi)

7、皮細胞的生理功能相關(guān)，在部分濃度下可能誘導內(nèi)皮細胞的凋亡，但主要機理是限制內(nèi)皮細胞間的相互連接和形成類毛細血管樣網(wǎng)絡(luò)，其通過在內(nèi)皮細胞內(nèi)的積聚加強內(nèi)皮細胞的敏感性。三維共培養(yǎng)模型提供了一個可供選擇的抗血管生成藥物篩選和療效評估平臺。 第三部分:可溶性VEGF受體2片斷靶向干預(yù)結(jié)直腸癌血管生成的體內(nèi)體外研究 結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴血管生成，刺激VEGF受體(VEGFR)能導致血管生成，阻斷VEGF和其信號通路能抑制腫瘤的

8、血管生成和腫瘤生長，在VEGFR的家族中VEGFR-2(Flk-1)是一個主要的腫瘤血管生成調(diào)節(jié)因子。本部分的目的是研究可溶性的VEGFR-2胞外區(qū)片斷(sFlk-1)的體內(nèi)、體外抗血管生成效應(yīng)。首先我們采用RT-PCR的方法從胎鼠肝臟擴增出sFlk-1，并和表達載體pcDNA3.1結(jié)合，然后將構(gòu)建的pcDNA3.1/sflk-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細胞。Westernblot分析檢測sFlk-1在LoVo/sFlk-1培養(yǎng)基中的表達，G4

9、18篩選穩(wěn)定表達的LoVo/sFlk-1克隆，并采用RT-PCR鑒定。分別使用了已經(jīng)成功構(gòu)建的腫瘤血管生成模型和荷人結(jié)直腸癌裸鼠移植模型，體內(nèi)外評估sFlk-1的體內(nèi)、體外抗血管生成效應(yīng)。LoVo/sFlk-1細胞和LoVo/nec細胞共移植的裸鼠為第一組(n=10)，LoVo/nec細胞和LoVo細胞共移植的裸鼠為第二組(n=10)。結(jié)果顯示：從胎鼠肝臟擴增出1307bp大小的sFlk-1片斷，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體和蛋白表達符合預(yù)

10、期結(jié)果，體外研究顯示sFlk-1能抑制內(nèi)皮細胞的功能和在LoVo細胞刺激所致的血管生成；體內(nèi)研究也顯示sFlk-1能抑制腫瘤血管生成和結(jié)直腸癌的生長，MVD檢測顯示第一組中的LoVo/sFlk-1細胞組和LoVo/nec細胞組的毛細血管密度分別是24.2±2.4和42.7±3.3。二者差異顯著。同時，與第二組中的LoVo/nec細胞組和LoVo細胞組比較，其毛細血管密度分別為63.1±2.7和61.2±3.3，說明sFlk-1不僅對其分