白介素17通過(guò)JAK-STAT通路促進(jìn)結(jié)直腸癌血管生成的研究.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)，也稱大腸癌，包括結(jié)腸、直腸和闌尾的癌腫，它是世界上第三大常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年在世界范圍內(nèi)會(huì)有655000人死于CRC[1]。CRC的發(fā)病率在不同地區(qū)具很大差異，以北美和大洋洲的發(fā)病率最高，而亞非地區(qū)較低。盡管我國(guó)是結(jié)直腸癌傳統(tǒng)低發(fā)病率國(guó)家，但隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及遺傳因素的影響，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)2012年腫瘤登記

2、年報(bào)報(bào)道，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率已躍居惡性腫瘤發(fā)病率第3位，死亡率已位居惡性腫瘤第5位[2]，在北京、上海、廣州等大城市大腸癌發(fā)病率排在第2或3位。所以，尋找治療CRC新的靶點(diǎn)，提高患者的生存質(zhì)量，是研究CRC的關(guān)鍵所在。
　　目前的研究認(rèn)為，惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程包括：腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，穿過(guò)基底膜細(xì)胞外基質(zhì)，遷移到周?chē)芎土馨凸埽竭_(dá)遠(yuǎn)處器官后與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，侵出血管外定植，形成轉(zhuǎn)移灶[3]。在這個(gè)過(guò)程中，血管生成被普遍認(rèn)為是

3、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)則是促進(jìn)血管生成中的關(guān)鍵因子[4]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，在腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞均有表達(dá)。已有大量研究證實(shí)VEGF在包括卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤表達(dá)增加，且與癌腫的血管密度、侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后密切相關(guān)。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中的趨炎

4、癥反應(yīng)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。白介素-17(Interleukin-17，IL-17)是主要由新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)T輔助細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的促炎癥作用，是核心的炎癥因子，積極參與多種炎癥和自身免疫性疾病，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起到重要作用[5]。但I(xiàn)L-17能否誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生VEGF繼而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)將研究IL-17對(duì)結(jié)直腸癌血管生成的影響，初步探討其可能分子學(xué)機(jī)制，為尋找抗腫瘤

5、血管生成靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。
　　研究目的：
　　探討IL-17對(duì)結(jié)直腸癌血管生成的影響及其可能分子學(xué)機(jī)制，為尋找抗腫瘤血管生成靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、收集50例結(jié)直腸癌手術(shù)患者術(shù)后標(biāo)本（癌組織、癌旁組織、正常組織），采用QRT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)IL-17mRNA、IL-17蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況。
　　2、收集100例結(jié)直腸癌患者的病理切片，通過(guò)免疫組化方

6、法，檢測(cè)IL-17在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，分析IL-17的表達(dá)與結(jié)直腸癌微血管密度（MVD）的相關(guān)性及與臨床病理因素的關(guān)系。
　　3、體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480、LOVO），分別加入50ng/L rhIL-17對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，CCK-8法檢測(cè)IL-17對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的影響；Transwell法檢測(cè)IL-17對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲和遷移作用。
　　4、體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480、LOVO），分別加入50ng/L

7、 rhIL-17對(duì)其進(jìn)行刺激，QRT-PCR、Western Blot檢測(cè)IL-17對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株VEGF的表達(dá)影響。5、體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480、LOVO），分別加入50ng/L rhIL-17對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，QRT-PCR法檢測(cè)JAK-STAT通路中JAK mRNA、STAT mRNA的表達(dá)情況， Western Blot法檢測(cè)IL-17R、JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白的表達(dá)情況， ELISA檢測(cè)通路上下游關(guān)

8、鍵因子IL-6、IL-8的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、在結(jié)直腸癌組織中，我們發(fā)現(xiàn)IL-17mRNA、IL-17蛋白的表達(dá)水平依次為癌組織＞癌旁組織＞正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、在結(jié)直腸癌組織中，IL-17的陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，主要分布于癌巢周?chē)?00例結(jié)直腸癌組織病理切片中IL-17陽(yáng)性表達(dá)有75例，陰性表達(dá)有25例，50例正常黏膜組織病理切片中IL-17陽(yáng)性表達(dá)有16例，陰性表達(dá)有3

9、4例，IL-17在癌組織中表達(dá)顯著多于正常組織（2=11.191，P=0.001）。以血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34染腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，參考Weidner等人的方法，統(tǒng)計(jì)腫瘤MVD，然后分析其與IL-17表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)IL-17陽(yáng)性表達(dá)組MVD值為15.60±3.65， IL-17陰性表達(dá)組MVD值為11.15±1.44，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)得出結(jié)論：腫瘤MVD與IL-17的表達(dá)呈正相關(guān)(t=-5.920，r=0.567，P值為0.000

10、)，繼續(xù)分析IL-17的表達(dá)和MVD與臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-17的高表達(dá)與癌腫的侵潤(rùn)程度、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05)），MVD與癌腫的分化程度、組織學(xué)類(lèi)型、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。
　　3、CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，在無(wú)外源性IL-17刺激時(shí)，SW480和LOVO細(xì)胞能維持自主增殖狀態(tài)，加入50ng/L的IL-17作用24h、48h、72h后，SW480和LOVO細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)增殖反應(yīng)，SW4

11、80的細(xì)胞增殖率（％）分別為（1.18±0.07）%、（1.42±0.09）%、（1.62±0.08），LOVO細(xì)胞的增殖率（%）為（1.13±0.02）%、（1.32±0.05）%、（1.73±0.02）%，呈促進(jìn)增殖趨勢(shì)，與對(duì)照組比較有顯著差異（P<0.05）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，在無(wú)IL-17作用下，幾乎無(wú)穿膜細(xì)胞；IL-17作用兩株細(xì)胞后，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加，IL-17作用SW480細(xì)胞24h后，侵襲能力明顯增強(qiáng)，侵

12、襲細(xì)胞數(shù)為（34.00±0.45），明顯比對(duì)照組增多（t=-76.026，P=0.0012）；IL-17作用LOVO細(xì)胞24h后，侵襲能力明顯增強(qiáng)，侵襲細(xì)胞數(shù)為（41.60±0.51），明顯比對(duì)照組增多（t=-81.58，P=0.0047）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，在無(wú)IL-17作用下，只有少許穿膜細(xì)胞；IL-17作用兩株細(xì)胞后，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加，IL-17作用SW480細(xì)胞24h后，遷移能力明顯增強(qiáng)，遷移細(xì)胞數(shù)為（36.40

13、±0.0.51），明顯比對(duì)照組增多（t=51.54， p=0.0034）；IL-17作用LOVO細(xì)胞24h后，遷移能力明顯增強(qiáng)，遷移細(xì)胞數(shù)為（46.40±0.68），明顯比對(duì)照組增多（t=49.26，P=0.0049）
　　4、50ng/L rhIL-17對(duì)兩株結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行刺激后，QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17組VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17組VEGF蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.

14、05）。
　　5、50ng/L rhIL-17對(duì)兩株結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17組JAKmRNA、STATmRNA較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17組JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白較對(duì)照組表達(dá)量增加（P＜0.05）， ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-6、IL-8的表達(dá)情況，IL-17組高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　IL-