基因槍法導(dǎo)入GUS基因誘導(dǎo)小麥條銹菌毒性突變的研究.pdf

1、小麥條銹病是世界各小麥產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一，種植抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但是其病原小麥條銹菌(Puccinia striiformis f．sp．tritici)毒性變異頻繁，可以通過(guò)變異產(chǎn)生新的毒性小種，導(dǎo)致小麥品種抗病基因失效，引起小麥條銹病周期性流行危害。一般認(rèn)為小麥條銹菌毒性變異的主要途徑是基因突變和異核作用，其中基因突變是產(chǎn)生新的毒性基因的唯一途徑。因此，深入開(kāi)展小麥條銹菌的致病相關(guān)基因的研究，對(duì)解決小麥品種

2、抗病性喪失問(wèn)題有著十分重要的理論和實(shí)踐意義。本研究采用基因槍轉(zhuǎn)化法以帶有β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)告基因的質(zhì)粒pGUS6L20轉(zhuǎn)化小麥條銹菌，進(jìn)一步優(yōu)化條銹菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，分離和篩選小麥條銹菌毒性突變體，研究突變體的生物學(xué)特性。 獲得如下研究結(jié)果： 1.優(yōu)化了小麥條銹菌基因槍法轉(zhuǎn)化體系：為了提高基因槍的轉(zhuǎn)化率，本研究對(duì)CYR29遺傳轉(zhuǎn)化體系中主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)體系為采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Ra

3、d)，轟擊前小麥條銹菌夏孢子在4℃下萌動(dòng)2～2.5h，每槍夏孢子用量為0.7mg，金粉(直徑為0.61xm)用量為350gg，質(zhì)粒DNA為1μg，最適轟擊壓力為1190 psi，較適轟擊壓力為900psi和1350psi，轟擊時(shí)真空度為2.7×104pa，爆裂膜與承載膜之間的距離為2.5cm，承載膜與阻擋網(wǎng)之間的距離為0.8cm，阻擋網(wǎng)與靶細(xì)胞之間的距離為6cm。 2.探索小麥條銹菌夏孢子轉(zhuǎn)GUS基因遺傳轉(zhuǎn)化體的分離方法：以從菌

4、種篩選品種上分離轉(zhuǎn)化體法為主，從繁殖品種輝縣紅上分離轉(zhuǎn)化體法為輔可有效提高轉(zhuǎn)化體的檢出率。同時(shí)本研究建立了利用透明膠帶粘取夏孢子并通過(guò)染色分離小麥條銹菌轉(zhuǎn)GUS基因轉(zhuǎn)化體的新方法。 3.獲得了GUS基因瞬時(shí)表達(dá)菌株和毒性突變菌株：采用基因槍轉(zhuǎn)化法以帶有β-葡糖醛酸酶(GUS)報(bào)告基因的質(zhì)粒pGUS6L20轉(zhuǎn)化小麥條銹菌CYR29，在轉(zhuǎn)化當(dāng)代條銹菌中得到了GUS瞬時(shí)表達(dá)的菌株；連續(xù)繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，在轉(zhuǎn)化后T1和T2代條銹菌中檢測(cè)到

5、了GUS基因穩(wěn)定表達(dá)的菌株；利用GUS報(bào)告基因和毒性標(biāo)記相結(jié)合的方法，經(jīng)過(guò)三代篩選鑒定在小麥條銹菌中國(guó)鑒別寄主尤皮Ⅱ號(hào)上獲得了MJ-4和MJ-7兩個(gè)穩(wěn)定的毒性突變體，在抗引655上獲得了MK-2和MK-3兩個(gè)穩(wěn)定的毒性突變體；4個(gè)突變菌株對(duì)篩選品種都發(fā)生了毒性突變，MK-2引起的反應(yīng)型變化為0→3型，MJ-4、MJ-7和MK-3引起的反應(yīng)型變化為0→4型。經(jīng)PCR及PCR-southern blot證實(shí)外源片段已整合到毒性突變菌株的基因