中國西南地區(qū)貓源弓形蟲株基因分型及毒力研究.pdf

1、目的：研究流行于我國西南地區(qū)(貴陽)貓源弓形蟲株基因型分布及其毒力。探討其與中國其他地區(qū)有無遺傳差異,以及分離株對不同品系小鼠的毒力。
　　方法：從中國西南地區(qū)(貴陽)收集貓的標(biāo)本進行動物接種,分離蟲株,收集小鼠腹水中的速殖子進行提取DNA,經(jīng)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP),在SAG1,SAG2,SAG3,BTUB,GRA6,c22-8,c29-2,L358,PK1和Apico十個位點進行基因分型;反應(yīng)總體積

2、為50μl,其中PCRmastermix25μl、上下游引物各1μl、DNA模板1.5μl。擴增條件為94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性30s,60℃退火60s,72℃延伸90s,循環(huán)35次,最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,每管取5μlPCR產(chǎn)物在含溴化乙錠(EthidiumBromide,EB)的1％瓊脂糖凝膠中100V電泳30min,并在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。然后各管余下PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的內(nèi)切

3、酶酶切。酶切后產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳,0.5μg/ml溴化乙錠染色后,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳圖譜,并與參考蟲株圖譜進行對比。經(jīng)PBS稀釋的純化速殖子按1?103個/只腹腔感染SPF級KM,BALB/c,C57BL,ICR小鼠,每組10只。逐日觀察小鼠狀態(tài)并計算死亡率和存活時間,進行毒力分析。
　　結(jié)果：采用10個遺傳位點,從貴陽分離出2株弓形蟲株,經(jīng)PCR-RFLP分析揭示了1個基因型(ToxoDB＃9,China1)?；?/p>

4、因型China1型在SAG2、GRA6、L358、PKl、c22-8位點為基因II型;在SAG3、BTUB、c29-2位點為基因III型;在Apico位點為基因I型。BALB/c、C57BL、KM、ICR四個品系雌鼠各10只,經(jīng)腹腔接種1×103個CT-1蟲株速殖子。C57BL小鼠感染后第5天開始出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀甚至死亡,第6天完全死亡。BALB/c小鼠在第5、6、7這三天之內(nèi)全部死亡。KM小鼠感染后6-7天,活動減少,出

5、現(xiàn)弓背、豎毛等癥狀,第10天死亡2只小鼠,感染后第15天至觀察45天結(jié)束,小鼠恢復(fù)正?；顒?一直存活。ICR小鼠相對于BALB/c、C57BL小鼠癥狀輕微,在第10、14天分別死亡了2只和1只小鼠,其余的在45天內(nèi)存活。存活的感染小鼠45天后頸椎脫臼處死,腦組織壓片發(fā)現(xiàn)有大量包囊形成。通過進行不同品系小鼠毒力研究顯示:CT-1蟲株感染C57BL、BALB/c、KM、ICR小鼠死亡率有顯著差異(P<0.01),C57BL、BALB/c小鼠

6、兩者之間及KM、ICR小鼠兩者之間對蟲株無顯著差異(P>0.01)。
　　結(jié)論：雖然從世界各地人體和動物體內(nèi)分離得到的蟲株的基因分型結(jié)果顯示,各地剛地弓形蟲具有豐富的遺傳多態(tài)性。然而中國大陸蟲株的基因分型結(jié)果與歐洲、非洲和北美的3個優(yōu)勢克隆株系截然不同:流行中國的動物源性弓形蟲分離株具有有限的遺傳多樣性,弓形蟲China1為其優(yōu)勢基因型;在生物多樣性較為豐富的我國西南地區(qū)(貴陽),China1型(ToxoDB＃9)為其優(yōu)勢基因型,