基于新型MyD88信號通路抑制劑探索GVHD靶向防治新策略及其機理.pdf

1、第一部分 MyD88信號過表達與急性GVHD疾病進展的相關性
　　【目的】探討TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在小鼠異基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)中的表達及意義。
　　【方法】以雄性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠作為骨髓移植的供受者，術前受者接受致死劑量(8.0Gy)的全身照射處理，4~6小時內輸注供者來源的骨髓細胞(1*107)和不同數(shù)量的脾臟淋巴細胞(1*10

2、7，n=12或2*107，n=12)建立不同嚴重程度的小鼠急性GVHD模型，未接受任何處理的正常BALB/c小鼠作為空白對照(n=6)。以GVHD臨床評分，生存期，靶器官病理作為GVHD的評價指標；分別采用實時熒光定量 PCR，免疫組化和western blot法檢測 GVHD模型小鼠小腸組織中 TLR4、MyD88和NF-κBp65的表達；并統(tǒng)計其基因表達譜的改變與GVHD進展的相關性。
　　【結果】急性GVHD的病情進展依賴于

3、異基因脾臟淋巴細胞的輸注數(shù)量，隨GVHD的病情惡化，小腸組織中 TLR4、MyD88與 NF-κBp65的表達均呈上升趨勢。重度GVHD小鼠病變腸組織TLR4，NF-κBp65 mRNA水平較正常對照顯著升高(P<0.05)。組織中蛋白表達也有相同的趨勢。此外，TLR4、MyD88和NF-κB mRNA間的表達不僅呈正相關，而且其與GVHD的臨床評分也呈正相關(R=0.814，P<0.001；R=0.828，P<0.001；R=0.56

4、8，P=0.034)。
　　【結論】GVHD小鼠靶器官組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路呈明顯的活化狀態(tài)，基因轉錄和蛋白翻譯均有增強，且與 GVHD病情呈顯著的正相關，可作為藥物研發(fā)的新靶點。
　　第二部分新型MyD88抑制劑TJ-5緩解急性GVHD及機制
　　【目的】探討 MyD88抑制劑 TJ-M2010-5(TJ-5)對在小鼠異基因骨髓移植后急性GVHD的抑制作用及機制，基于天然免疫為GVHD的藥物治

5、療提供新思路。
　　【方法】(1)免疫共沉淀檢測TJ-5對MyD88同源二聚化的影響；流式細胞術及ELISA檢測TJ-5對DC成熟活化的影響；蛋白質印跡檢測TJ-5對DC內MyD88信號通路關鍵分子的表達影響；淋巴細胞混合培養(yǎng)檢測TJ-5對異基因T淋巴細胞增殖的作用。(2)建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的小鼠骨髓移植后急性GVHD模型。實驗分為四組：GVHD空白對照組，TJ-5治療組，CD40L單抗(

6、MR1)治療組，聯(lián)合治療組。術后以 GVHD臨床評分，生存期，靶器官病理，炎性因子水平，組織壞死與修復，嵌合體形成及特異性耐受的形成作為藥物療效的評價指標，比較兩藥單獨用藥的差異及聯(lián)合用藥治療GVHD的效果。
　　【結果】 TJ-5能夠劑量依賴性的抑制MyD88分子的同源二聚化和LPS刺激引起的DC成熟，減少其上清液中炎性因子IL-1α，IL-10，IL-12和IL-18分泌；隨TJ-5劑量增加，DC表面TLR4的表達逐漸升高，而

7、下游分子IRAK4，NF-Bp65的表達卻明顯降低；TJ-5能減少DC/T混培體系中CD4+T和CD8+T淋巴細胞的增殖。移植后觀察60天，TJ-5與MR1組生存期，GVHD臨床評分均顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)；聯(lián)合用藥效果更佳，60天生存率達100％，明顯高于MR1組(70%)，TJ-5組(57%)和對照組(0%)；對照組小鼠肝臟，小腸，皮膚組織Thomas GVHD病理分級Ⅲ~Ⅳ級，其余三組靶器官病變較輕，呈Ⅰ~Ⅱ級改變。TJ-

8、5治療可加速異基因嵌合體的形成，明顯改善GVHD小鼠血循環(huán)中炎性因子，減少靶器官細胞凋亡，并促進組織修復。
　　【結論】新型MyD88抑制劑TJ-5可緩解小鼠骨髓移植后GVHD的進展，天然免疫與獲得性免疫系統(tǒng)同時抑制策略可取得更好的抗GVHD效果，具有廣闊的應用前景。
　　第三部分 TJ-5對荷骨髓瘤小鼠骨髓移植后GVT的影響
　　【目的】探討MyD88抑制劑TJ-M2010-5(TJ-5)在抗GVHD的同時能否保留G

9、VT效應，為TJ-5的臨床應用提供進一步實驗依據。
　　【方法】建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的GVHD荷骨髓瘤(SP2/0)小鼠模型。實驗分為三組：骨髓重建對照組，腫瘤復發(fā)組，單純T細胞組，T細胞與TJ-5共同作用組。小鼠的死亡歸結為GVHD相關死亡和腫瘤復發(fā)相關死亡進行評價。觀察60天，記錄各組GVHD體重變化，繪制臨床評分和生存曲線。對GVT靶器官脾臟和骨髓進行病理檢測；流式細胞術檢測TJ-5對

10、骨髓瘤細胞系SP2/0凋亡壞死和細胞周期的影響，對DC表面趨化因子CCR7表達的影響和對受者脾臟內Treg的比例的影響，以進一步明確保留GVT效應的可能機制。
　　【結果】 TJ-5治療組與GVT對照組60天存活率分別為50%與12.6%，荷瘤死亡率組間有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.04)，TJ-5組GVT靶器官骨髓，脾臟組織病變減輕，腫瘤細胞浸潤減少，與單純GVT對照組相比，并未觀察到削弱的GVT改變。在體外實驗條件下，TJ-5可劑

11、量依賴的促進骨髓瘤SP2/0細胞的的凋亡與壞死，并使SP2/0細胞的增殖生長周期停滯在G1期；TJ-5可抑制LPS導致的DC表面趨化分子CCR7的表達上調；經TJ-5治療后的GVHD小鼠脾臟內Treg的含量明顯增高，差異據有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　【結論】TJ-5治療荷瘤GVHD小鼠過程中對移植物GVT效果并無明顯的抑制作用。TJ-5保留GVT效應的機制可能與直接誘導腫瘤細胞死亡，趨化因子CCR7表達下調，受體Treg含

12、量增加有關。
　　第四部分單純宿主MyD88基因缺陷無GVHD保護作用
　　【目的】探討宿主來源MyD88分子在異基因骨髓移植后急性GVHD進展中的作用，為TJ-5臨床應用時間窗提供實驗依據。
　　【方法】以野生型(wt)或 MyD88基因敲除(ko) BALB/c(H-2Kd)小鼠作為受體，C57BL/6(H-2Kb)小鼠為供體，建立小鼠急性GVHD模型。觀察30天，以生存期，體重變化，GVHD臨床評分，病理，炎性因

13、子水平作為GVHD評價指標。激光共聚焦技術評價供者源性細胞在宿主體內的增殖情況，確定細胞類型與效應；ELISA檢測受體內LPS的水平差異；免疫組化檢測腸上皮細胞的增殖與凋亡；蛋白印跡法檢測腸上皮細胞內MyD88依賴性Cox-2信號的表達；實時定量PCR檢測腸上皮緊密連接蛋白(ZO-1，claudin-3和occludin)的表達評價腸屏障功能；淋巴細胞混合培養(yǎng)技術檢測受體MyD88敲除對異基因淋巴細胞增殖的影響。
　　【結果】在相

14、同的預處理實驗條件下，MyD88-/-小鼠較wt宿主表現(xiàn)出更嚴重的GVHD：生存時間，體重下降，GVHD臨床評分均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；MyD88敲除加重肝臟和小腸病理損傷，增加外周循環(huán)中 LPS的含量和組織中 GVHD相關炎性分子(TNF-α、IL-4和IL-12)的表達。相對于野生型受體而言，MyD88-/-小鼠脾臟，小腸和肝臟內有更多的H-2kb陽性的供者細胞和DC浸潤，腸上皮細胞凋亡增加，增殖減少。MyD88依賴的Co

15、x-2的表達在MyD88-/-小鼠腸上皮細胞中顯著下降(P<0.05)；腸上皮緊密連接分子ZO-1，claudin-3和occludin在MyD88-/-GVHD小鼠腸道和肝臟中的表達均明顯下降，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MyD88基因缺陷未明顯降低混培體系中的異基因淋巴細胞增殖。
　　【結論】宿主MyD88分子在GVHD進展中起到一定的保護作用，機制與減少供者效應細胞的浸潤，增加腸上皮屏障的穩(wěn)定性與黏膜保護性分子C