RNA干擾抑制多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤FGF-2和B7-H1表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 1、體外研究大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF／FGF-2)以及人類(lèi)多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251程序性死亡配體-1(programmeddeathreceptorligand1，PD-L1／B7-H1)的表達(dá)，并對(duì)照血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)比較低氧條件下FGF-2表達(dá)量的變化以及IFN．Y對(duì)于B7-H1的誘導(dǎo)作用。 2、研究不同序列

2、siRNA在體外對(duì)于目的基因表達(dá)的影響，探討不同序列和不同作用位點(diǎn)siRNA對(duì)目的基因的抑制作用。在mRNA和蛋白質(zhì)水平，研究siRNA體外對(duì)目的基因表達(dá)的抑制作用，并探討siRNA轉(zhuǎn)染濃度、轉(zhuǎn)染時(shí)間和目的基因表達(dá)之間的相關(guān)性。 3、研究siRNA體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，探討比較亂序siRNA和不同轉(zhuǎn)染濃度特異性siRNA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。研究FGF-2siRNA體外對(duì)C6細(xì)胞凋亡和周期的影響，探討比較不同轉(zhuǎn)染濃度，不

3、同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡和周期的變化。 4、研究FGF-2siRNA體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，比較不同劑量FGF-2siRNA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。 方法： 1、體外C6細(xì)胞系氯化鈷(CoCl2)l00uM低氧培養(yǎng)，IFN-γ500u／ml誘導(dǎo)U251細(xì)胞表達(dá)B7-H1，24小時(shí)后抽取實(shí)驗(yàn)組與空白組總RNA，RT-PCR檢測(cè)C6細(xì)胞FGF-2和VEGF以及U251細(xì)胞B7-HlmRNA的表達(dá)。 2、轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞不

4、同序列FGF-2siRNA，48小時(shí)后抽取總RNA，RT-PCR檢測(cè)FGF-2mRNA表達(dá)；轉(zhuǎn)染U25l細(xì)胞150nM不同序列B7-H1siRNA，24小時(shí)之后流式細(xì)胞儀檢測(cè)B7-H1的表達(dá)，篩選有效siRNA。 3、轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞及U251細(xì)胞不同濃度siRNA，24、48和72小時(shí)之后抽取總RNA，RT-PCR檢測(cè)靶基因mRNA的表達(dá)。12、24、48和72小時(shí)小時(shí)之后提取C6細(xì)胞總蛋白，Westemblot檢測(cè)FGF-2蛋白

5、的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251細(xì)胞B7-H1蛋白的表達(dá)。 4、轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞及U251細(xì)胞不同濃度siRNA，分別與0d、2d、5d、8d和10d，WST-8比色法測(cè)定吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 5、轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞不同濃度FGF-2siRNA，分別于24h、48h和72h流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化。 6、將C6細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成瘤后處死裸鼠分離培養(yǎng)成瘤細(xì)胞，將成瘤細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成瘤后按不同劑量瘤內(nèi)注射F

6、GF-2siRNA，每天測(cè)量腫瘤體積，10天后處死裸鼠，腫瘤稱(chēng)重。 結(jié)果： 1、低氧條件下C6細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，F(xiàn)GF-2的表達(dá)無(wú)明顯變化(P=0.787＞0.05)。IFN．Y體外能有效誘導(dǎo)U25l膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞B7-H1的表達(dá)：條帶灰度比值，誘導(dǎo)組B7-H1表達(dá)為0．4972±0．0209，空白組為0．1228±0．0142，P<0.001。 2、FGF-2siRNA-A抑制效率高于

7、siRNA-B：轉(zhuǎn)染200nM濃度siRNA后，siRNA-A的抑制率>80％，siRNA-B的抑制率～70％，P=0.01＜0．05。B7-H1siRNA-A抑制效率高于siRNA-B／C：空白對(duì)照組B7-H1蛋白表達(dá)70．01灶2．198％，siRNA-A、siRNA-B和siRNA-C的蛋白表達(dá)率分別為33．200±3．093％、61．290±1．965％和63．930±2．420％，siRNA-B和．C分別與siRNA-A兩兩比

8、較，P＜0.001。 3、siRNA可有效抑制目的基因的表達(dá)：FGF-2siRNA，50nM轉(zhuǎn)染濃度時(shí)FGF-2mRNART-PCR產(chǎn)物灰度比值0．1874±0．0120，與空白對(duì)照組(O．6893±0．0161)比較，P70％。B7-H1siRNA，200nM轉(zhuǎn)染濃度時(shí)，R

9、T-PCR灰度比值0．1426±0．0070，與空白對(duì)照組(0．5450±0．0179)比較出現(xiàn)較為顯著的抑制效率>70％，P<0.001：流式細(xì)胞檢測(cè)400nM轉(zhuǎn)染濃度時(shí)B7-H1蛋白表達(dá)34．030±1．960％，與空白對(duì)照組(69．876±2．114％)相比，呈現(xiàn)出較為明顯的抑制效果＞50％，P＜0.001。 4、siRNA抑制持續(xù)時(shí)間：各時(shí)間段RT-PCR產(chǎn)物灰度掃面與Oh對(duì)照組比較P＜0.001，48h對(duì)FGF-2的抑

10、制率>85％，對(duì)B7-H1的抑制率～70％。持續(xù)時(shí)間>3天。 5、陰性對(duì)照siRNA(N．C．siRNA)對(duì)目的基因的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用：FGF-2PCR產(chǎn)物灰度比值，空白組0．7073±0．013l；陰性對(duì)照組0．6928±0．0232，P=0.102＞0．05；Westemblot檢測(cè)，空白對(duì)照組灰度比值為0．4730±0．0867，陰性對(duì)照組為0．4537±0．0854，P=0.622＞0．05；B7-H1陰性對(duì)照組RT-

11、PCR產(chǎn)物灰度比值0．5412±0．0188，與空白對(duì)照組(O．5450±0．0179)比較，P=0.993＞0．05。 6、RNA干擾對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響：轉(zhuǎn)染200-600nMFGF-2siRNA，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，吸光度(A)值差異性顯著P<0.001。C6細(xì)胞增殖抑制被明顯抑制。不同濃度B7-H1siRNA處理組之間U251細(xì)胞的吸光度值差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.125>0.05。 7、抑制FG

12、F-2的表達(dá)使C6細(xì)胞阻滯在S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染24h時(shí)間點(diǎn)S期細(xì)胞分布在37-39％，48hS期細(xì)胞分布在44-5l％，轉(zhuǎn)染300nM，72h后，S期細(xì)胞53．423±0．612％，P＜0．001。轉(zhuǎn)染24h和48h后，凋亡不明顯，其凋亡百分比＜3％，P＞0．05，轉(zhuǎn)染72h后，出現(xiàn)明顯凋亡，400nM轉(zhuǎn)染濃度時(shí)C6細(xì)胞凋亡百分比為26．508+2．770％，P＜0．001。 8、siRNA腫瘤內(nèi)注射明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)：空

13、白對(duì)照組與陰性對(duì)照組腫瘤的生長(zhǎng)差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=1．000＞0.05，各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，腫瘤的生長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性顯著，P＜0.01，空白與陰性對(duì)照組腫瘤重量分別為1．512±0．139g、1．498±0．118g，P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2．6gg實(shí)驗(yàn)組、4．0gg和5．3μg實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量與空白對(duì)照組比較P＜0.001。siRNA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制呈劑量依賴(lài)關(guān)系：siRNA注射劑量與腫瘤重量成負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0

14、．933，回歸分析決定系數(shù)R2=O．871，P＜0.001。 9、siRNA轉(zhuǎn)染濃度與B7-HlmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)系：相關(guān)回歸分析，轉(zhuǎn)染濃度與B7-H1mRNA表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)為r=-0．958，P＜0．001，濃度與B7-H1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)r=-O．975，P＜0.001，B7-H1mRNA與蛋白表達(dá)相關(guān)系數(shù)r=0.928，R2=0．862，P＜O．001。 結(jié)論： l、低氧培養(yǎng)對(duì)于C6細(xì)胞FG

15、F-2的表達(dá)無(wú)影響，而能明顯誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，F(xiàn)GF-2和VEGF可能通過(guò)不同的途徑促經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管形成。IFN-Y．在體外可以明顯誘導(dǎo)U25l細(xì)胞B7-H1表達(dá)，可能由干擾素調(diào)控因子-1(IRF-1)結(jié)合于B7-H1啟動(dòng)子通過(guò)JAK／STAT途徑誘導(dǎo)表達(dá)。 2、不同序列siRNA對(duì)目的基因的抑制效率不同，與序列本身和目的基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及siRNA作用位點(diǎn)的熱動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)有關(guān)。低濃度siRNA即可抑制目的基

16、因的表達(dá)，陰性對(duì)照siRNA對(duì)目的基因的表達(dá)無(wú)抑制作用，RNA干擾具有很高的特異性，其抑制效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)抑制持續(xù)時(shí)間>3天，非持續(xù)的抑制效應(yīng)與siRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)被RNA酶降解有關(guān)。siRNA對(duì)目的基因的抑制與轉(zhuǎn)染濃度成直線(xiàn)相關(guān)。 3、在體外，RNA干擾抑制FGF-2的表達(dá)，明顯抑制C6細(xì)胞的增殖，對(duì)增殖的抑制率與轉(zhuǎn)染濃度有關(guān)，F(xiàn)GF-2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖具有重要的作用,RNA干擾抑制U25l細(xì)胞B7-H1的表

17、達(dá)，在體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的影響，B7-H1就膠質(zhì)瘤本身而言對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，可能對(duì)腫瘤特異性的CTL細(xì)胞有影響。siRNA抑制FGF-2的表達(dá)使C6細(xì)胞阻滯在S期，G2／M期細(xì)胞減少，較高濃度的FGF-2siRNA體外能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，可能通過(guò)p53/n21Waft信號(hào)途徑過(guò)度表達(dá)RFT，引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。 4、FGF-2siRNA在裸鼠體內(nèi)明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)生長(zhǎng)的抑制與siRNA的利量成直