非編碼RNA干預手段治療膠質母細胞瘤的機制研究.pdf

1、目的：
　　1.為了驗證miR-23b海綿表達慢病毒載體對miR-23b的表達水平、miR-23b靶蛋白VHL相關的下游信號通路和膠質母細胞瘤細胞體內外促血管生成、侵襲及遷移能力的抑制作用。
　　2.為了探索SNORD76與HOTAIR表達改變之間的關系、在膠質母細胞瘤中的功能及可能的作用機制、過表達SNORD76對膠質母細胞瘤裸鼠原位模型的影響及SNORD76在不同級別膠質瘤臨床標本中的表達情況。
　　方法：

2、　　1.用表達 miR-23b海綿的慢病毒載體感染膠質母細胞瘤細胞系 U87-MG、LN229和U251后，利用定量PCR檢測細胞內miR-23b表達水平變化、Western blot技術檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達變化，采用體外血管形成模擬實驗、Transwell實驗及劃痕實驗分別檢測膠質母細胞瘤促血管形成、侵襲和遷移相關惡性表型的變化。
　　2.建立膠質母細胞瘤U87-MG裸鼠原位瘤模型，利用小動物活體成像系統(tǒng)實時監(jiān)測

3、原位移植瘤的生長速度，免疫組織化學染色檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達變化、CD31染色檢測新生血管情況及H&E染色檢測腫瘤組織向非腫瘤組織侵襲或遷移的情況。
　　3.利用定量 PCR技術分別檢測實驗室常規(guī)培培養(yǎng)細胞系 U87-MG、U87-EGFRvIII、LN229、U251和SNB19中HOTAIR、SNORD76和GAS5的基礎表達水平，利用表達HOTAIR siRNA和全長序列慢病毒載體分別感染高表達和低表達HOTA

4、IR的膠質母細胞瘤細胞系后，檢測HOTAIR、SNORD76和GAS5的表達變化。
　　4.分別對低表達和高表達SNORD76的膠質母細胞瘤細胞系采用SNORD76過表達慢病毒處理和SNORD76 siRNA處理后，分別利用MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測膠質母細胞瘤細胞增殖能力的改變。
　　5.利用 PI染色流式細胞學技術檢測過表達 SNORD76對細胞周期的影響，隨后Western blot技術檢測細胞周期相關蛋白的改

5、變。
　　6.建立SNORD76過表達組和對照組的U87-MG裸鼠膠質母細胞瘤原位模型，利用小動物成像系統(tǒng)監(jiān)測原位移植瘤的生長情況，利用免疫組織化學染色檢測相關蛋白的表達變化。
　　7.定量PCR技術檢測WHO分級II級膠質瘤標本20例、III級22例和IV級（膠質母細胞瘤）21例中SNORD76和GAS5的表達情況。
　　結果：
　　1.定量PCR結果顯示在膠質母細胞瘤細胞系中表達miR-23b海綿慢病毒可以抑

6、制～50％的miR-23b表達，而Western blot結果顯示與血管生成（VEGFA和HIF-1α）、侵襲和遷移（β-catenin、ZEB1、MMP2及MMP9）相關蛋白表達減少，而與侵襲和遷移能力負相關的蛋白VHL和E-cadherin表達增加，體外功能實驗結果提示 miR-23b海綿表達慢病毒抑制膠質母細胞瘤促血管生成、侵襲和遷移能力。
　　2.小動物活體成像結果證明 miR-23b海綿處理組原位移植瘤的生長速度較慢而裸

7、鼠平均生存期較長，免疫組織化學染色顯示CD31染色陽性新生血管的數量減少及腫瘤細胞向正常腦組織侵襲和遷移的細胞少，腫瘤與非腫瘤組織交界處較平滑，并且差異表達蛋白檢測結果同Western blot結果。
　　3. HOTAIR過表達組細胞中SNORD76表達減少，而HOTAIR siRNA處理組中SNORD76表達增加，GAS5的表達水平可能不受HOTAIR表達改變的影響。4. MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗結果表明，過表達 SNO

8、RD76抑制膠質母細胞瘤細胞增殖而敲低 SNORD76表達后促進膠質母細胞瘤增殖，過表達SNORD76的膠質母細胞瘤細胞出現細胞周期S期阻滯，而進一步用Western blot檢測細胞周期相關蛋白變化后發(fā)現Rb、pRb表達增加而cyclin A1、cyclin B1及p107表達降低。
　　5.膠質母細胞瘤U87-MG裸鼠原位模型實驗結果表明，過表達SNORD76處理組原位瘤增大較對照組慢而裸鼠生存期較長，H&E染色結果說明處理組

9、腫瘤組織較對照組小，免疫組織化學檢測細胞周期相關蛋白表達變化與Western blot中變化一致。
　　6.定量PCR技術檢測了不同級別膠質瘤臨床標本結果發(fā)現GAS5的表達在不同級別膠質瘤中沒有統(tǒng)計學差異，而SNORD76在膠質母細胞瘤中特異性低表達。
　　結論：
　　1. miR-23b海綿通過提高miR-23b靶點蛋白VHL表達進而抑制膠質母細胞瘤細胞的促血管生成、侵襲和遷移能力。
　　2.體內實驗中過表達m