Wnt-β-catenin信號通路在納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用和機(jī)理研究.pdf

1、研究目的：
　　 如何研制具有良好骨整合性能的骨科內(nèi)植物材料是當(dāng)前骨科關(guān)注的焦點(diǎn)之一，而內(nèi)植物骨整合性能研究的本質(zhì)是研究材料與細(xì)胞之間的相互作用，其中納米尺度上的研究更是當(dāng)前研究的重點(diǎn)方向之一。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)納米人工骨材料具有更好的成骨能力和整合性能，但其機(jī)制尚不清楚。本研究旨在從細(xì)胞信號通路的角度揭示材料表面納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞作用的可能機(jī)制，從而為更好地研制具有良好骨整合性的骨科植入物提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究方

2、法：
　　 通過紫外干涉光刻制備規(guī)則、有序的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，利用原子力學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡對該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并通過急性毒性試驗(yàn)、刺激與致敏試驗(yàn)、急性溶血試驗(yàn)、體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)初步對此種方法制備的特定納米結(jié)構(gòu)的安全性進(jìn)行評價；從人髂前上棘的骨髓中分離、擴(kuò)增、培養(yǎng)細(xì)胞，分別使用成骨誘導(dǎo)體系、成脂誘導(dǎo)體系對獲得的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，組織學(xué)觀察并分別進(jìn)行茜素紅、油紅素O染色；利用流式細(xì)胞儀對獲得的細(xì)胞進(jìn)行表面抗原CD29、CD34、C

3、D44、CD45、CD105分析，對細(xì)胞進(jìn)行了初步鑒定；在納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用CCK-8方法對納米結(jié)構(gòu)上細(xì)胞增殖情況進(jìn)行評估，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨橋蛋白(OPN)、微管蛋白(Vinculin)在納米結(jié)構(gòu)上的表達(dá)情況。RT-PCR半定量分析Ⅰ型膠原蛋白(COL)，骨橋蛋白(OPN)。免疫組化方法對納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上細(xì)胞進(jìn)行β-Catenin、GSK～3β染色，激光

4、共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 研究結(jié)果：
　　 構(gòu)建了大面積的可應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的新型納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有良好的生物安全性。獲得了具有成骨、成脂分化能力并高表達(dá)CD29、CD44、CD105，低表達(dá)CD34、CD45的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上具有較好的延展性，良好的增殖能力，并具有較高的堿性磷酸酶表達(dá)，而細(xì)胞骨橋蛋白與微管蛋白同樣在納米結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高表達(dá)。Wnt信號通路的重要組

5、分β-Catenin、GSK-3β在納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的細(xì)胞內(nèi)具有較高表達(dá)。
　　 研究結(jié)論：
　　 激光干涉光刻法可以制備大面積、規(guī)則、有序、具有良好的生物相容性的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。應(yīng)用松質(zhì)骨沖洗液及骨髓全液培養(yǎng)的方法，可較短時間內(nèi)獲得較大數(shù)量具有良好增值能力，可以穩(wěn)定傳代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)在納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖、活性和向成骨細(xì)胞分化的生物學(xué)特征，Wnt信號通路中兩個重要的組分