上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在慢性鼻—鼻竇炎中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分慢性鼻-鼻竇炎(CRS)患者鼻腔/鼻竇黏膜中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)現(xiàn)象
　　 目的：檢測(cè)慢性鼻-鼻竇炎(CRS)患者和對(duì)照組患者鼻腔/鼻竇黏膜中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，分析CRS與EMT的關(guān)系。
　　 方法：收集2009年9月-2011年2月期間我院耳鼻咽喉科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者鼻腔/鼻竇黏膜組織標(biāo)本共39例，其中慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)、慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(CRSsN

2、P)和非CRS患者各13例，Real-time PCR方法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、E-鈣粘附蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞纖連蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)的mRNA水平。采用Westernblot檢測(cè)上述標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平，以免疫組織熒光方法進(jìn)行蛋白表達(dá)定位。
　　 結(jié)果：與

3、非CRS患者相比，CRSsNP患者鼻腔/鼻竇黏膜組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin的mRNA相對(duì)水平升高(P=0.032；P=0.048；P=0.001)，而CRSwNP患者的α-SMA、vimentin的mRNA相對(duì)水平下降(P=0.001；P=0.011)；CRSsNP患者的α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、MMP-9的蛋白表達(dá)升高(P<0.001；P<0.001；P=0.006；P=0.033=。C

4、RSsNP組和CRSwNP組比較發(fā)現(xiàn)，CRSsNP患者的α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、fibronectin、vimentin的mRNA相對(duì)水平較高(P=0.000；P=0.038；P=0.005；P=0.000；P=0.000)，蛋白水平呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)。免疫組織熒光檢測(cè)證實(shí)α-SMA和角蛋白主要表達(dá)于鼻腔/鼻竇黏膜組織的上皮層和基底膜。在mRNA水平，α-SMA與TGF-β1、fibronectin、vimentin

5、的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.443，P=0.005；r=0.596，P=0.000；r=0.501，P<0.001)；在蛋白水平，α-SMA與TGF-β1、MMP-9、E-cadherin、fibronectin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.918，P=0.000；r=0.415，P=0.009；r=0.395，P=0.013；r=0.486，P=0.002)。
　　 結(jié)論：CRSsNP患者鼻腔/鼻竇黏膜組織中α-SMA表達(dá)增加，并與TG

6、F-β1、MMP-9、fibronectin表達(dá)增強(qiáng)呈正相關(guān)，提示EMT可能是CRSsNP的發(fā)病機(jī)制之一。而在CRSwNP患者，α-SMA的表達(dá)較正常下降，提示在CRSwNP患者的鼻腔/鼻竇黏膜組織中可能不存在EMT現(xiàn)象。
　　 第二部分 EMT在CRS中的意義及其對(duì)鼻內(nèi)鏡手術(shù)預(yù)后的影響
　　 目的：研究上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在CRS中的意義及其對(duì)鼻內(nèi)鏡術(shù)后CRS預(yù)后的影響。
　　 方法：所有入組病例行內(nèi)鏡下鼻

7、竇手術(shù)(ESS)。術(shù)前收集第一部分中26個(gè)CRS患者的臨床資料，包括病程，是否伴有過敏性鼻炎、哮喘、阿司匹林過敏、胃食管返流，有無鼻竇手術(shù)史，吸煙史等，對(duì)患者的CRS癥狀進(jìn)行RSOM-31評(píng)分；體格檢查確定是否伴有鼻息肉；對(duì)術(shù)前鼻竇CT進(jìn)行Lund-Mackay評(píng)分，進(jìn)行Lund-Kennedy內(nèi)鏡評(píng)分。術(shù)后隨訪26例患者進(jìn)行癥狀(RSOM-31評(píng)分)和體征(Lund-Kennedy內(nèi)鏡評(píng)分)，評(píng)價(jià)預(yù)后。統(tǒng)計(jì)分析EMT的標(biāo)志物α-平滑肌

8、肌動(dòng)蛋白(α-SMA)與術(shù)前搜集所得臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性，評(píng)估EMT在CRS中的意義；分析α-SMA與術(shù)后患者癥狀、內(nèi)鏡評(píng)分的相關(guān)性評(píng)價(jià)EMT對(duì)CRS患者預(yù)后的影響。
　　 結(jié)果：除吸煙史(r=-0.402，P=0.042)外，患者是否伴有過敏性鼻炎、哮喘、阿司匹林過敏、胃食管返流以及鼻竇手術(shù)史、病程等均不影響EMT的發(fā)生，但是血清總IgE呈現(xiàn)與EMT負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)(r=-0.371，P=0.062)；前組篩竇的CT評(píng)分與α-SMA蛋

9、白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.389，P=0.049)；術(shù)前各項(xiàng)癥狀的評(píng)分與α-SMA蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性；而術(shù)后嗅覺下降、聽力減退、感覺疲勞、工作能力下降等癥狀的評(píng)分與α-SMA蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.472，P=0.015；r=0.413，P=0.036；r=-0.537，P=0.005；r=0.420，P=0.033)；術(shù)前內(nèi)鏡評(píng)分總分、術(shù)后息肉評(píng)分、分泌物評(píng)分、內(nèi)鏡評(píng)分總分與α-SMA蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-

10、0.408，P=0.038；r=-0.439，P=0.025；r=-0.421，P=0.032；r=-0.640，P<0.001)。
　　 結(jié)論：病變涉及其他鼻竇而未涉及前組篩竇的CRS患者可能較容易發(fā)生EMT；EMT雖然與術(shù)前各種癥狀不具相關(guān)性，但是可能影響患者術(shù)后的嗅覺、聽力改善以及疲勞、工作能力下降等癥狀。EMT與內(nèi)鏡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，并影響術(shù)后息肉和分泌物等內(nèi)鏡下體征的改變。
　　 第三部分 CRS鼻腔/鼻竇黏膜原代

11、上皮細(xì)胞體外模型的建立
　　 目的：建立慢性鼻-鼻竇炎(CRS)鼻腔/鼻竇黏膜原代上皮細(xì)胞模型。
　　 方法：于內(nèi)鏡下鼻竇手術(shù)術(shù)中取息肉、中鼻甲或者鉤突黏膜組織，過夜消化，分別以差速貼壁+胰酶消化法和免疫磁珠分選法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分別以免疫熒光標(biāo)記角蛋白抗體半定量法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩種方法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞純度。
　　 結(jié)果：免疫熒光定量法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫磁珠分選法培養(yǎng)上皮細(xì)胞的純度為89.3％；差速貼壁+胰酶消化法培養(yǎng)

12、的上皮細(xì)胞純度為85.6％；而流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫磁珠分選法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞純度可以達(dá)到92.12％；差速貼壁+胰酶消化法培養(yǎng)的上皮細(xì)胞純度可以達(dá)到78.37％；符合上皮，間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 結(jié)論：差速貼壁+胰酶消化法和免疫磁珠分選法兩種細(xì)胞純化、培養(yǎng)方法均可以建立純度較高的人類鼻腔/鼻竇黏膜原代上皮細(xì)胞模型，為進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了模型基礎(chǔ)。
　　 第四部分轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的EMT

13、研究
　　 目的：通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證人類鼻腔/鼻竇黏膜上皮細(xì)胞可以發(fā)生EMT。
　　 方法：采用差速貼壁+胰酶消化法或免疫磁珠分選法培養(yǎng)出純度較高的上皮細(xì)胞，以10ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用免疫熒光雙標(biāo)(α-SMA和角蛋白)檢測(cè)發(fā)生EMT的細(xì)胞；以不同濃度(1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)的TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞，Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志

14、物α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)；劃痕實(shí)驗(yàn)觀察TGF-β1誘導(dǎo)后的上皮細(xì)胞的遷移能力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)后的上皮細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)果：經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后的上皮細(xì)胞形態(tài)變化明顯；免疫熒光雙標(biāo)顯示同時(shí)標(biāo)記上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的細(xì)胞；Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)后的細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)上調(diào)；劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF