Toll樣受體的激活對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞功能的影響研究.pdf

1、背景：
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的非造血多能干細(xì)胞，廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并能在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，心肌細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等，是細(xì)胞替代治療和組織工程的首選種子細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞是一類免疫缺陷細(xì)胞，具有低免疫源性和免疫調(diào)節(jié)特性，主要通過細(xì)胞間接觸和可溶性因子的分泌發(fā)揮免

2、疫抑制功能，是移植領(lǐng)域和自身性免疫疾病治療的研究熱點(diǎn)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是目前研究最為深入的一種模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，可對病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）進(jìn)行識別，結(jié)合，并引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在先天性免疫和獲

3、得性免疫中均發(fā)揮重要作用。它們不僅參與病原微生物免疫應(yīng)答的信號傳導(dǎo)過程，抵抗病毒，細(xì)菌及寄生蟲等病原微生物的感染，同時(shí)也參與腫瘤免疫，自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)。近年來研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞也表達(dá)有多種功能性的TLRs，而且不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)TLRs的情況不同，TLRs信號通路的活化可能影響其增殖，分化，遷移和免疫抑制功能，但確切的作用還有待進(jìn)一步的闡明。
　　 目的：
　　 臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便

4、，無倫理學(xué)限制，免疫原性低，增殖能力和免疫抑制能力強(qiáng)等明顯優(yōu)勢，有可能成為最具有臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。本研究旨在觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中TLRs的表達(dá)情況，揭示TLRs的激活對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，分化，免疫調(diào)節(jié)能力的影響，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。
　　 方怯：
　　 (1)應(yīng)用Real-time PCR方法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中TLRs的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。<

5、br>　　 (2)共聚焦熒光顯微鏡，Western Blot方法檢測TLRs配體刺激臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的活化情況，并用Real-time PCR方法檢測TLRs配體刺激后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的變化情況，從而明確臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的TLRs是否具有功能性。
　　 (3)TLRs特異性配體刺激臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，采用CCK8試劑盒檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況。
　　 (4)在

6、含或不含TLRs配體的誘導(dǎo)體系中，定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，用油紅O染色、Von Kossa染色、茜素紅染色觀測脂滴形成、鈣鹽沉積情況，并用RT-PCR方法檢測分化標(biāo)志蛋白(LPL，CEBPD，BMP-2，OC)的表達(dá)情況，以觀察TLRs的激活對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能的影響。
　　 (5)體外建立人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人外周血單個(gè)核細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，利用Brdu摻入實(shí)驗(yàn)檢測人外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖

7、情況，并且用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測其IFN-γ(interfem-γ)的分泌水平，從而反映人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對活化后的單個(gè)核細(xì)胞的免疫抑制作用以及TLRs配體的刺激對于這一作用的影響。
　　 (6)應(yīng)用ELISA試劑盒檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)上清中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的含量，比較TLRs配體刺激組與非刺激組之間的差異；Real-time PCR方法檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中吲

8、哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)，IFN-β(interfern-β)的mRNA水平的表達(dá)情況，Western Blot法檢測TLRs配體刺激后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子IRF-3的活化情況，以探討TLRs的激活對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制作用的影響中可能存在的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 (1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)有TLRs，主要是TLR2，TLR3，TLR4和TL

9、R9這五種亞型。
　　 (2)采用TLRs各亞型相應(yīng)的配體刺激臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，可活化NF-kB信號途徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子mRNA水平的表達(dá)。
　　 (3)TLR3配體的刺激可劑量依賴性地抑制臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。
　　 (4)在含有TLR3配體的誘導(dǎo)條件下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)，成脂分化標(biāo)志物的表達(dá)明顯升高；而TLR4配體的刺激則減弱其成脂分化能力。
　　 (5)TLR3配體