上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其介導(dǎo)的纖維化與子宮腺肌癥的相關(guān)性研究.pdf

1、子宮腺肌病(Adenomyosis，ADM)作為子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)的“內(nèi)在性”表現(xiàn)，是子宮內(nèi)膜侵入子宮肌層的一種良性病變。ADM最常發(fā)生在子宮后壁，臨床主要表現(xiàn)為經(jīng)量增多和經(jīng)期延長(zhǎng)、進(jìn)行性痛經(jīng)和性交痛、性欲減退等，約35％的患者無任何臨床癥狀或僅感到輕微的不適。核磁共振(MRI)近年來作為確診腺肌病的檢查手段開始逐漸被應(yīng)用于臨床，而在MRI之前，確診ADM的唯一辦法是子宮切除后的病理檢查。這樣往往延誤了

2、患者的求診，導(dǎo)致就診時(shí)大多病情或癥狀已進(jìn)展較重，最終只能以全子宮切除為結(jié)局，因此對(duì)育齡期婦女的傷害尤為巨大。
　　ADM的病因至今不清楚。目前多數(shù)研究者認(rèn)為ADM是基底層內(nèi)膜細(xì)胞增生、侵入到肌層間質(zhì)的結(jié)果。而關(guān)于引起內(nèi)膜基底層細(xì)胞侵入肌層的因素尚不清楚。
　　上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。在EMT過程

3、中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，喪失細(xì)胞間緊密連接和粘附連接，獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移能力，變成了具有間質(zhì)細(xì)胞功能和特性的細(xì)胞。EMT在腫瘤中賦予細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)的能力。而ADM的內(nèi)膜細(xì)胞的侵入過程與這一過程非常相似，因此本課題通過研究ADM發(fā)生發(fā)展中相關(guān)因子，探討EMT與ADM的關(guān)系。
　　第一部分 他莫昔芬誘導(dǎo)的ICR小鼠腺肌癥模型
　　目的:利用他莫昔芬的誘導(dǎo)作用，對(duì)ICR小鼠進(jìn)行ADM的建模。
　　方法:購入10只ICR

4、孕鼠（孕周17-19周），將新生小鼠的雌性小鼠隨機(jī)平均分為建模組和對(duì)照組。出生當(dāng)天算第0天第1天至第5天給予TAM(濃度200μg/mL)誘導(dǎo)，按5μL/g的劑量直接口服給予建模組新生小鼠，對(duì)照組予相同劑量的空白溶劑。建模組和對(duì)照組再分別隨機(jī)分為5組，分別在第5天、第10天、第15天、第42天和第60天以10％水合氯醛麻醉，心臟灌注處死，取小鼠Y型子宮，保存在4％多聚甲醛里。石蠟包埋后，橫截面切片保存。同時(shí)，小鼠斷奶后(21天時(shí))與母鼠

5、分隔開，在第28天、第42天和第56天分別行熱板實(shí)驗(yàn)。將熱板儀設(shè)定溫度為55℃，待溫度達(dá)到后將小鼠置于熱板儀的熱板上面，開始計(jì)時(shí)，以小鼠開始舔舐后腳掌或從熱板上跳起為結(jié)束。這段時(shí)間視為小鼠的熱板實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。
　　結(jié)果:HE染色觀察，建模組5天時(shí)未見異位內(nèi)膜侵入小鼠子宮肌層;10天時(shí)，有2/5例侵入小鼠子宮肌層;15天時(shí)，有3/5例侵入肌層;42天時(shí)，全部建模組小鼠子宮均可見腺體侵入肌層;60天時(shí)，侵入肌層的腺體較大，個(gè)數(shù)較多。對(duì)照

6、組未見異位內(nèi)膜。對(duì)照組熱板實(shí)驗(yàn)有輕微的下降，建模組每組時(shí)間均低于對(duì)照組，且呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，與對(duì)照組有明顯差別。
　　結(jié)論:TAM口服給藥誘導(dǎo)了ICR小鼠的ADM形成。42天時(shí)，建模成功率為100％。建模過程中ICR小鼠建模組的痛覺耐受力也有下降。
　　第二部分 上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化在腺肌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用
　　目的:探討EMT相關(guān)因子在ADM形成過程中的表達(dá)，以及EMT在此過程中的作用。
　　方法:利用免疫

7、組化方法對(duì)ADM小鼠子宮及ADM患者病灶標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。主要檢測(cè)EMT的相關(guān)因子E-cadherin、Vimentin，以及EMT的TGF-β/Smad3通路中的TGF-β、p-Smad3、Six1的表達(dá)，通過對(duì)比表達(dá)量的變化，探討ADM發(fā)生發(fā)展過程中的EMT的作用。
　　結(jié)果:ADM建模組小鼠的E-cadherin在建模過程中表達(dá)降低。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0

8、.05)。在ADM患者的免疫組化染色中觀察到，在子宮肌層中可見異位腺上皮細(xì)胞，與對(duì)照組的在位腺上皮的E-cadherin免疫組化染色相比明顯變淺。兩組間有顯著差異(p＜0.05)。
　　ADM建模組小鼠的Vimentin在建模過程中在異位內(nèi)膜的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者的Vimentin表達(dá)于異位內(nèi)膜，與對(duì)照組的在位腺上皮相比有顯

9、著差異(p＜0.05)。
　　ADM建模組小鼠的TGF-β在建模過程中在異位內(nèi)膜的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者的TGF-β表達(dá)于異位內(nèi)膜，與對(duì)照組的在位腺上皮相比有顯著差異(p＜0.05)。
　　ADM建模組小鼠的Six1在建模過程中在異位內(nèi)膜胞核內(nèi)的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)

10、間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者的Six1表達(dá)于異位內(nèi)膜胞核，與對(duì)照組的在位腺上皮相比有顯著差異(p＜0.05)。
　　ADM建模組小鼠的p-Smad3在建模過程中在異位內(nèi)膜胞核內(nèi)的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者的p-Smad3表達(dá)于異位內(nèi)膜胞核，與對(duì)照組的在位腺上皮相比有顯著差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論

11、:ADM形成過程中涉及EMT的發(fā)生，并與Six1調(diào)控的TGF-β/Smad3通路相關(guān)。
　　第三部分 EMT導(dǎo)致的纖維化在腺肌癥發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:通過特殊染色及纖維化相關(guān)因子的檢測(cè)，觀察在EMT導(dǎo)致的ADM中是否存在纖維化的發(fā)生。
　　方法:利用Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色對(duì)ADM建模成功的小鼠子宮及ADM異位病灶進(jìn)行染色，利用纖維對(duì)染料的特殊感應(yīng)，檢測(cè)ADM中是否有膠原纖維的生成。同時(shí)用免疫組化的

12、方法對(duì)ADM小鼠子宮及ADM異位病灶進(jìn)行α-SMA及CollagenⅠ表達(dá)量的檢測(cè)，探討ADM中纖維化的可能。
　　結(jié)果:Masson染色:在ADM建模組小鼠中，42和60天組小鼠子宮整個(gè)間質(zhì)部分可見藍(lán)色纖維染色彌漫性分布，腺體及肌層呈現(xiàn)紅色;ADM患者切片病灶處可見大片紅色肌肉纖維，之間夾雜紅色腺體及藍(lán)色纖維。
　　苦味酸-天狼星紅染色:普通光學(xué)顯微鏡下觀察，ADM小鼠子宮腺上皮及肌層呈黃色，42天及60天的建模組小鼠間質(zhì)

13、內(nèi)彌漫分布紅色纖維狀染色;ADM患者腺體與肌纖維均為黃色，肌纖維之間及腺體周圍有紅色染色，400倍鏡下觀察可見纖維狀。偏振光顯微鏡下觀察，光鏡下紅色纖維部分可見紅黃綠三色膠原纖維交織分布，紅黃兩色光較強(qiáng)，纖維較粗，綠色光弱，纖維較細(xì)。ADM小鼠近病灶處折光較強(qiáng)，紅黃光較多;ADM患者異位內(nèi)膜周圍折光強(qiáng)，紅黃光多于綠光。
　　ADM建模組小鼠的CollagenⅠ在建模過程中在異位內(nèi)膜的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p

14、＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者的CollagenⅠ表達(dá)于異位內(nèi)膜及其周圍間質(zhì)內(nèi)，與對(duì)照組的在位腺上皮相比有顯著差異(p＜0.05)。
　　ADM建模組小鼠的α-SMA除了子宮肌層的表達(dá)，建模過程中在異位內(nèi)膜的表達(dá)升高。相同天數(shù)的建模組與對(duì)照組有顯著差異(p＜0.05)，建模組的不同時(shí)間的5組間也有顯著差異(p＜0.05)。而ADM患者除了肌層外，其α-SMA表達(dá)于異位內(nèi)膜及其周圍間