5-雜氮脫氧胞苷對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24增殖及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　 據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2006 年在美國(guó),膀胱癌在男性是繼前列腺癌、肺癌和直腸癌以后排名第4位的惡性腫瘤,在女性排名第9位。大約有6萬(wàn)余人被臨床醫(yī)生診斷為膀胱癌,每年1萬(wàn)余人死于膀胱癌,絕大多數(shù)膀胱癌為移行細(xì)胞癌以浸潤(rùn)的方式生長(zhǎng),復(fù)發(fā)率為 50％～70％。雖然膀胱癌可用局部治療控制,但仍有 10％～15％的表淺性膀胱移行細(xì)胞癌最終發(fā)展成為肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌或發(fā)生其他部位轉(zhuǎn)移。盡管淺表性膀胱癌生存率較高,預(yù)后較好,但

2、膀胱部分切除后局部復(fù)發(fā)率為 38％～80％,其中 50％在手術(shù)后1年發(fā)生,約2/3在手術(shù)后第二年發(fā)生。膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的主要因?yàn)?(1)腫瘤細(xì)胞在手術(shù)中殘余、脫落種植是重要因?yàn)橹?2)腫瘤細(xì)胞沿膀胱肌肉壁內(nèi)淋巴管擴(kuò)散,實(shí)際侵犯膀胱壁肉眼所見(jiàn)寬廣,腫瘤不能充分切除。(3)有學(xué)者認(rèn)為膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的唯一預(yù)后因素是腫瘤分期。(4)肉眼難以發(fā)現(xiàn)的原位癌和癌前病變的發(fā)展。(5)膀胱上皮繼續(xù)受到尿內(nèi)致癌物質(zhì)的刺激。因此,研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及

3、早期治療就顯得尤為重要。隨著近年來(lái)腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展,膀胱癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制也有相當(dāng)進(jìn)展。基因機(jī)制和表觀遺傳學(xué)機(jī)制是腫瘤形成過(guò)程中的兩大類機(jī)制,基因機(jī)制包括原癌基因激活、抑癌基因失活(點(diǎn)突變、缺失、插入、重排、擴(kuò)增)及染色體異常,表觀遺傳學(xué)機(jī)制包括 DNA 甲基化異常,組蛋白修飾,編碼 RNAs(包括 microRNA),染色質(zhì)重塑等,甲基化異常主要指甲基基團(tuán)與基因組中 CpG 二核苷酸的胞嘧啶區(qū)高甲基化CpG島的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)因D

4、NA甲基化沉默的抑癌基因,這已成為一種尋找腫瘤相關(guān)基因的新方法。目前的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以做到能檢測(cè)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),并且可以DNA甲基化的抑制范圍進(jìn)行定量,從而為評(píng)估腫瘤風(fēng)險(xiǎn)、制定預(yù)防策略、獲得早期診斷和跟蹤腫瘤預(yù)后提供指導(dǎo)。由甲基化引起基因沉默而出現(xiàn)的腫瘤,可通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶非競(jìng)爭(zhēng)性或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制甲基化的發(fā)生,活化沉默的抑癌基因,從而達(dá)到治療腫瘤的目的。去甲基化藥物:5-氮胞嘧啶和5-氮-2’-脫氧胞嘧啶可以抑制甲基轉(zhuǎn)

5、移酶活性,在一些難治性腫瘤,特別是在白血病治療方面已取得了較好的療效。5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-cdr)是一種 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1(DNMT1)的抑制劑,可抑制 DNMT1的功能,從而逆轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子的高甲基化,使基因重新表達(dá)。很多體外研究證實(shí),5-aza-cdr通過(guò)去甲基化作用使多種CPG島超甲基化的抑癌基因重新表達(dá),從而恢復(fù)抑癌功能,例如在淋巴瘤,胃癌,乳腺癌中。但5-aza-cdr對(duì)人膀胱癌T24 細(xì)胞株 DAPK的

6、作用國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將使用不同濃度的5-aza-dc在不同時(shí)間處理 T24 細(xì)胞株,檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞株增殖,凋亡的生物學(xué)影響及其相關(guān)機(jī)制,為膀胱癌的診療提供新途徑。
　　 研究目的：
　　 探討 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 5-雜氮脫氧胞苷(5-aza-dc)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株 T24 增殖、凋亡的影響及可能的作用機(jī)制,尋找膀胱癌基因治療的新方法。
　　 研究方法
　　 細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1

7、640+10％胎牛血清。在37℃、5％CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每12-24h換液1次,視細(xì)胞生長(zhǎng)情況,在細(xì)胞接近鋪滿培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板底時(shí)(4-5天后)進(jìn)行傳代。消化細(xì)胞用0.25％胰酶的PBS液(0.01 μmol/L)。T24細(xì)胞在胰酶處理30秒左右后需終止消化。應(yīng)用不同濃度(0.1,0.5,2.5,12.5 μ mol/L)的特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc,于不同作用時(shí)間(6,12,24,48h)處理人膀胱癌

8、細(xì)胞株T24。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定不同濃度的5-aza-dc在不同時(shí)間作用下 T24細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率,將MTT加入經(jīng)不同濃度5-aza-Cdr處理前后的膀胱癌T24細(xì)胞,DMSO充分溶解后,置全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值,細(xì)胞增殖能力以平均吸光度(A)值分析,以A值為縱坐標(biāo),時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度(0.1,0.5,2.5,12.5 μ mol/L)的5-aza-d

9、c在處理T24細(xì)胞24h后的凋亡率變化情況。用甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)藥物處理前后死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
　　 研究結(jié)果
　　 1、實(shí)驗(yàn)組各濃度 5-aza-dc 對(duì) T24 細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用,各濃度組對(duì) T24細(xì)胞的抑制作用與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.01)。
　　 2、MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),同一作用時(shí)間下不同藥物濃度的5-aza-dc(0.1,0.5,2.5,12.5

10、 μmol/L,)對(duì) T24 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用為劑量依賴性；同一濃度組對(duì) T24 細(xì)胞的抑制作用在 24 內(nèi)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.01),而當(dāng)濃度為12.5 μmol/L時(shí),超過(guò)24h后再延長(zhǎng)作用時(shí)間其抑制率變化不明顯。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度為 12.5 μmol/L的5-aza-dc 作用24h時(shí)對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最明顯(抑制率為 24.01±0.25)。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Annexin V/PI 雙染法)

11、膀胱癌 T24 細(xì)胞在不同濃度5-aza-dc(0.1、0.5、2.5、12.5 μmol/L)作用24小時(shí)后,會(huì)出現(xiàn)明顯凋亡。用藥組與對(duì)照組比較,細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而增高,當(dāng)濃度為 12.5μ mol/L時(shí),細(xì)胞凋亡率為(24.12±1.4)％。各濃度5-aza-dc 作用的細(xì)胞凋亡率有顯著差異(P<0.01),T24 細(xì)胞的凋亡率存在濃度依賴性。
　　 4、MSP 法檢測(cè)正常培養(yǎng)條件下 T24 細(xì)胞的DAPK 基因啟動(dòng)

12、子甲基化狀態(tài)的結(jié)果顯示:甲基化引物擴(kuò)增條帶為陽(yáng)性,未甲基化引物擴(kuò)增條帶為陰性。5-aza-dc(12.5 μmol/L)作用24小時(shí)后,T24 細(xì)胞甲基化引物擴(kuò)增條帶為陰性,未甲基化引物擴(kuò)增條帶為陽(yáng)性。提示膀胱癌細(xì)胞株 T24 中 DAPK 基因啟動(dòng)子存在高甲基化,去甲基化藥物 5-aza-dc 可成功逆轉(zhuǎn) DAPK 啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài),使其成為未甲基化狀態(tài)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、本研究證實(shí)5-aza-dc對(duì)人膀