胰腺星狀細(xì)胞在胰腺纖維化中的作用及丹酚酸B的干預(yù)阻斷研究.pdf

1、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是指由于各種不同病因引起的胰腺組織和功能的持續(xù)性損害，其特征為胰腺基本結(jié)構(gòu)發(fā)生永久性改變，廣泛纖維化，即使病因已去除仍常伴胰腺的功能性缺陷。慢性胰腺炎病程遷延，臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重影響患者的日常生活。并且有報(bào)道認(rèn)為慢性胰腺炎是胰腺癌的危險(xiǎn)因素之一。但目前對(duì)慢性胰腺炎的病因、發(fā)病機(jī)制尚不甚清楚，慢性胰腺炎的治療更為棘手。 胰腺纖維化的形成是一個(gè)由復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路所介導(dǎo)的、

2、以胰腺星狀細(xì)胞活化為中心、多種細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)參與的、最終以成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積為特征的復(fù)雜的病理發(fā)展過(guò)程。胰腺星狀細(xì)胞活化是胰腺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵步驟，因此抑制胰腺星狀細(xì)胞活化在抗胰腺纖維化過(guò)程中占有重要地位。 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)細(xì)胞因子、乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、氧應(yīng)激等能促進(jìn)胰腺星狀細(xì)胞活化?；罨囊认傩菭罴?xì)胞分泌ECM成分，促進(jìn)胰腺纖維化形成。在胰腺星狀細(xì)胞活化通路中，絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-a

3、ctivated protein kinase，MAPKs)信號(hào)傳遞途徑是最為重要一條。ERK通路的主要功能是介導(dǎo)有絲分裂信號(hào)向胞核傳遞，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。Jaster等在研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)通路與PSC活化的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)化階段的PSC都能持續(xù)表達(dá)磷酸化的Smads；血小板衍生生長(zhǎng)因子( PDGF)在促進(jìn)PSC增殖的同時(shí)增加ERK通路成分的表達(dá)；應(yīng)用Trapidil或PD98059(MAPK激酶的抑制劑)均可

4、以抑制PSC的增殖。這也證實(shí)ERK通路在PSC的活化中起到了重要作用。 丹酚酸B( Salvianolic acid B，Sal-B)，又稱丹參酚酸B或丹酚酸乙，是唇形科植物丹參Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根莖提取而得，為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成。丹酚酸B具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)之功效，是目前研究較多的丹酚酸之一，對(duì)心、腦、肝、腎等器官均具有重要藥理作用。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有很強(qiáng)的抗氧化、

5、抗纖維化、抗腫瘤作用，抑制血小板聚集和抑制血栓形成作用，并能延長(zhǎng)缺氧條件下動(dòng)物的存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B能抑制TGF-β的肝星狀細(xì)胞胞( HSC)內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其受體蛋白的表達(dá)，拮抗TGF-β的促HSC活化，還能抑制HSC增殖和膠原合成。 方法： 1)動(dòng)物模型建立與胰腺星狀細(xì)胞評(píng)價(jià) 雄性大鼠行膽胰管注射2％TNBS乙醇磷酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型，分別于術(shù)后2周4周和8周處死大鼠行胰腺病理學(xué)檢查，采用文獻(xiàn)報(bào)道

6、的胰腺組織學(xué)評(píng)分方法，主要評(píng)價(jià)胰腺腺泡細(xì)胞萎縮，纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；免疫組化檢測(cè)胰腺星狀細(xì)胞活化的情況；RT-PCR檢測(cè)I膠原蛋白mRNA表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的對(duì)照組。 2)丹酚酸B動(dòng)物試驗(yàn) 雄性大鼠行膽胰管注射2％TNBS乙醇磷酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型，分為模型對(duì)照組(組1)和丹酚酸B治療組(組2)，組3是膽胰管注射乙醇磷酸鹽緩沖液的對(duì)照組(非模型對(duì)照組)，組4是假手術(shù)組。30只大鼠膽胰管注射2％TNBS乙醇磷

7、酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型，12只大鼠膽胰管注射乙醇磷酸鹽緩沖液，12只大鼠接受假手術(shù)。每組各取10只大鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)，第5周開(kāi)始，組2接受每天10mg/kg體重的丹酚酸B灌胃治療，組1、組3和組4接受等體積的生理鹽水灌胃，共治療8周。治療結(jié)束時(shí)抽取血標(biāo)本，分離血清，行血清生化和纖維化指標(biāo)檢測(cè)；同時(shí)分離胰腺稱重，并取胰腺組織中性福爾馬林固定用于形態(tài)學(xué)研究；免疫組化檢測(cè)胰腺星狀細(xì)胞活化的情況；取部分胰腺組織抽提總RNA檢測(cè)I膠原蛋白mR

8、NA表達(dá)水平。 3)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 采用MTT方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞PSC(LTC-14，德國(guó)Robert Jaster教授饋贈(zèng))，用0.25％胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，作細(xì)胞計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為2×104/ml的單細(xì)胞懸液，每孔190ul接種于96孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。將稀釋為不同濃度的丹酚酸B10ul分別加入各孔中(終濃度為1μmol/L，10μmol/L，100μ

9、mol/L)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)只加細(xì)胞不加藥液的對(duì)照孔和只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行MTT檢測(cè)。選擇570nm波長(zhǎng)，在免疫酶標(biāo)儀上比色測(cè)定OD值，記錄結(jié)果。 4)丹酚酸B細(xì)胞試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LTC-14細(xì)胞，消化為單個(gè)細(xì)胞，以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，每孔接種4×104的單細(xì)胞懸液于6孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。將稀釋為不同濃度的丹

10、酚酸B加入各孔中(終濃度為1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L)，以等體積的PBS作為對(duì)照。培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞抽提總RNA行RT-PCR檢測(cè)alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白和I型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平。免疫印跡檢測(cè)I型膠原蛋白和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶( ERK1/2)表達(dá)水平。 結(jié)果： 1)動(dòng)物模型建立與胰腺星狀細(xì)胞評(píng)價(jià) 膽胰管注射TNBS成功誘導(dǎo)慢性胰腺炎，術(shù)后第2周胰腺組織有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯

11、萎縮和纖維化，免疫組化提示少量alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，第4周胰腺組織表面蒼白、不規(guī)則、結(jié)節(jié)狀，膽胰管明顯擴(kuò)張，內(nèi)含淡黃色液體；HE染色光鏡觀察胰管周圍、小葉間和小葉內(nèi)廣泛纖維化，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶腺體萎縮，免疫組化明顯alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，第8周胰腺組織改變與第4周相似，但病理該變更嚴(yán)重，alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞更多。術(shù)后第2周胰腺組織I型膠原蛋白mRNA水平已經(jīng)升高，第4周胰腺組織I型膠原蛋白mR

12、NA水平明顯升高，第8周升高幅度更大。 2)丹酚酸B動(dòng)物試驗(yàn) (1)丹酚酸B改善大鼠慢性胰腺炎模型病理形態(tài)：第12周末，模型對(duì)照組大鼠胰腺腺泡萎縮、間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化明顯。丹酚酸B可以明顯改善胰腺組織病理?yè)p害。與模型對(duì)照組和丹酚酸B治療組比較，非模型對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠胰腺無(wú)或僅有輕微病理?yè)p害。模型對(duì)照組大鼠胰腺的組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于丹酚酸B治療組(p<0.01)。丹酚酸B治療組大鼠胰腺的腺泡萎縮和纖維化評(píng)

13、分明顯低于模型對(duì)照組(p<0.05)，而炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分沒(méi)有差別(p>0.05)。 (2)丹酚酸B抑制大鼠慢性胰腺炎模型的胰腺星狀細(xì)胞活化：模型對(duì)照組大鼠胰腺中有明顯的alpha-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。與模型對(duì)照組和丹酚酸B治療組比較，非模型對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠胰腺僅有少數(shù)alpha-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。丹酚酸B治療組大鼠胰腺的alpha-SMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于模型對(duì)照組。 (3)丹酚酸B抑制慢性胰腺炎模型胰腺組織I膠原蛋白mRN

14、A表達(dá)：與模型對(duì)照組比較，丹酚酸B可以明顯抑制胰腺組織I膠原蛋白mRNA表達(dá)(p<0.01)。與非模型對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠相比，模型對(duì)照組大鼠的胰腺組織I膠原蛋白mRNA水平明顯升高(p<0.01)，而丹酚酸B治療組大鼠的胰腺組織I膠原蛋白mRNA升高水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 3)胰腺星狀細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 根據(jù)MTT結(jié)果，丹酚酸B1μmol/L組對(duì)PSC細(xì)胞沒(méi)有明顯的增殖抑制作用(p>0.05)，而丹酚酸B1

15、0μ mol/L和100μ mol/L組與對(duì)照組相比，丹酚酸B對(duì)PSC細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用(p<0.01)。 4)丹酚酸B細(xì)胞試驗(yàn) (1)丹酚酸B抑制胰腺星狀細(xì)胞alpha平滑肌肌動(dòng)蛋白和I型膠原蛋白mRNA表達(dá)：與對(duì)照組相比，丹酚酸B組胰腺星狀細(xì)胞alpha平滑肌肌動(dòng)蛋白和I型膠原蛋白mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而且隨著丹酚酸B1μ mol/L，10μ mol/L和100μmol/L逐步升高，胰腺星狀細(xì)胞alpha平滑肌

16、肌動(dòng)蛋白和I型膠原蛋白mRNA；表達(dá)逐步下調(diào)。 (2)丹酚酸B抑制胰腺星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)：與對(duì)照組相比，丹酚酸B1μmol/L組胰腺星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)沒(méi)有下調(diào)，但丹酚酸B10μmol/L和100μ mol/L組胰腺星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著丹酚酸B濃度升高，胰腺星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐步下調(diào)。 (3)丹酚酸B抑制胰腺星狀細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達(dá)：與對(duì)照組相比，丹酚酸B組胰腺星

17、狀細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達(dá)明顯下調(diào)，而且隨著丹酚酸B1μmol/L，10μmol/L和100μ mol/L逐步升高，胰腺星狀細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶( ERK1/2)表達(dá)逐步下調(diào)。 結(jié)論： 1)膽胰管注射法誘導(dǎo)的慢性胰腺炎模型基本符合人類慢性胰腺炎特征，胰腺星狀細(xì)胞在慢性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用： 2)丹酚酸B通過(guò)抑制胰腺星狀細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶活性，降低alpha平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)水