外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA檢測(cè)在腎移植早期排斥反應(yīng)中的作用探討.pdf

1、目的： 1．建立檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)人類主要組織相容性抗原-A(HLA-A)mRNA的一步法熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)的方法，初步應(yīng)用于腎移植患者移植前后外周血淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA表達(dá)的檢測(cè)。探討淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA的表達(dá)與機(jī)體免疫狀態(tài)及移植后早期急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 2．通過(guò)對(duì)HLA-AmRNA、CD4/CD8比值、血肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)、淋巴細(xì)胞數(shù)各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2、，探討淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA作為早期急性排異反應(yīng)評(píng)估指標(biāo)的價(jià)值。 方法： 依據(jù)GenBank中人HLA-AmRNA序列，根據(jù)HLA-A基因外顯子4、5中的保守序列自主設(shè)計(jì)、篩選引物及探針；以管家基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose6-phosphate dehydrogenasem，G6PDH)作為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)引物及探針。運(yùn)用Taqman探針技術(shù)，熒光定量RT-PCR擴(kuò)增HLA-A mRNA和G6PDH m

3、RNA。檢測(cè)35例隨訪的腎移植患者的術(shù)前及術(shù)后半年內(nèi)不同時(shí)間的標(biāo)本的閾循環(huán)數(shù)(Ct)和60例正常對(duì)照的閾循環(huán)數(shù)(Ct)，采用REST軟件分析其外周血淋巴細(xì)胞表面HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定值大于等于正常值或者在連續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中表達(dá)較前顯著增強(qiáng)的腎移植患者，考慮有早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生。以流式細(xì)胞術(shù)連續(xù)檢測(cè)CD4/CD8比值，ELISA檢測(cè)免疫抑制劑藥物濃度，評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)。血生化儀測(cè)定血肌酐、尿素氮。 結(jié)果：

4、 1．健康正常對(duì)照人群外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量是(1.14±0.32)。將此值設(shè)為目前外周血淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA檢測(cè)的臨界值。 2．移植前外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量(1.03±0.56)與正常對(duì)照比較無(wú)差異(P>0.05)。 3．術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑，腎功能穩(wěn)定組一月內(nèi)外周血淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA的相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組相比均降低(P<0.05)。 4．

5、術(shù)后急性排斥反應(yīng)組排斥反應(yīng)期外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA的相對(duì)表達(dá)升高(P<0.05)。與腎功能穩(wěn)定組同一時(shí)間相比，5例排斥反應(yīng)患者術(shù)后一月內(nèi)不同時(shí)間外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA表達(dá)在排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)顯著升高(P<0.05)。 5．HLA-A mRNA作為監(jiān)測(cè)早期急性排斥反應(yīng)的指標(biāo)的敏感性是80％，特異性是90.3％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)率是66.7％，陰性預(yù)測(cè)率是96.5％。結(jié)合血肌酐檢測(cè)，可提高其檢測(cè)的敏感性和特異性。

6、 6．移植術(shù)前后連續(xù)監(jiān)測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4/CD8比值，排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，比值均>1.5。血藥濃度監(jiān)測(cè)，口服藥物吸收不規(guī)則，存在很大的個(gè)體差異。HLA-A單項(xiàng)診斷排斥反應(yīng)時(shí)變化更明顯，性能優(yōu)于其他指標(biāo)。 結(jié)論： 1．成功建立了簡(jiǎn)便快速、特異、重復(fù)性好、可信度高的檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA基因表達(dá)的FQ-RT-PCR方法。結(jié)合REStT軟件，采用比較Ct值

7、的分析方法對(duì)淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA進(jìn)行相對(duì)定量。 2．外周血淋巴細(xì)胞HLA-AmRNA作為一個(gè)評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)和預(yù)測(cè)早期排斥反應(yīng)發(fā)生的指標(biāo)具有無(wú)創(chuàng)性，敏感性80％，特異性90.3％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)率66.7％，陰性預(yù)測(cè)率96.5％的特點(diǎn)。結(jié)合臨床血肌酐指標(biāo)，可以進(jìn)一步提高HLA-A mRNA檢測(cè)的敏感性和特異性，使外周血淋巴細(xì)胞HLA-A mRNA檢測(cè)具有良好的預(yù)測(cè)早期排斥反應(yīng)的前景。 3．HLA-A mRNA、血