十字花科黑腐病菌小RNA直接靶標鑒定.pdf

1、細菌小RNA(Small RNA，sRNA)是一類長度為50-500 nt，通常不編碼蛋白但具有獨立功能的RNA分子。研究表明，細菌小RNA在重金屬離子代謝、環(huán)境應答、群體感應、生物膜的形成以及病原菌的致病性等方面發(fā)揮了重要的作用。細菌小RNA發(fā)揮功能的主要方式是通常與其靶標mRNA以堿基配對的方式結合從而影響該mRNA的翻譯或穩(wěn)定性，因此在轉錄后水平調控靶標基因的表達。
　　十字花科黑腐病(Xanthomonas campest

2、ris pv.campestris，Xcc)是引起白菜、甘藍、蘿卜、油菜等重要十字花科作物黑腐病的病原菌，同時也是研究植物病原細菌致病機理的模式菌株之一。為了研究小RNA在Xcc中的作用，我們課題組幾年前就開展了小RNA鑒定和功能研究工作。到目前為止，我們已經(jīng)從Xcc中已鑒定了幾十個小RNA;此外，我們還采用缺失和過量表達方法對部分小RNA進行了功能鑒定，但只有極少數(shù)的小RNA的生物學功能得到確定，而大部分小RNA的缺失和過量表達都沒有

3、觀察到表型變化，說明大多數(shù)小RNA的功能是微效的，為此，本研究嘗試通過鑒定小RNA的直接靶標來研究小RNA在細胞中的作用。我們的策略是，先用生物信息學預測目的小RNA的直接靶標，再用凝膠阻滯實驗(EMSA)進行驗證。
　　在已鑒定的幾十個Xcc小RNA中，我們選擇了4個(sRNA-Xcc1、 sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4）表達豐度較高的小RNA作為我們的目的小RNA。我們首先用CopraRNA(Com

4、parativeprediction algorithm for small RNA target)軟件預測了這4個小RNA的直接靶標。預測結果顯示，在p值＜0.01且q值＜0.5的篩選條件下，sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc2、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4的靶標基因分別為27個、2個、3個和35個。接著我們選擇了5個sRNA-Xcc1的預測靶標(XC_2374、XC_1589、XC_0611、XC_1788、XC_072

5、1)，2個sRNA-Xcc2的預測靶標(XC_4321、XC_1078)，3個sRNA-Xcc3的預測靶標（XC_1548、XC_0725、XC_0690）和5個sRNA-Xcc4的預測靶標(XC_0760、XC_3379、XC_3499、XC_3561、XC_2308)進行EMSA實驗驗證。在進行EMSA前，我們先用5'RACE(5'RapidAmplification of cDNA Ends)確定了候選靶標基因的轉錄起始位點。結果

6、發(fā)現(xiàn)只有XC_0725的轉錄起始位點位于預測的sRNA-Xcc3的結合區(qū)位點之前。另外，我們課題組之前已經(jīng)鑒定了XC4321的轉錄起始位點，也位于預測的sRNA-Xcc2的結合位點之前。于是，我們對這兩個候選靶標進行EMSA驗證。但是，EMSA結果顯示sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3均不能與對應的預測靶標RNA結合，說明XC_4321不是sRNA-Xcc2的直接靶標，XC_0725也不是sRNA-Xcc3的直接靶標，或者它們與靶標

7、的結合需要其它因子參與。
　　為了明確sRNA-Xcc2和sRNA-Xcc3是否調控候選靶標基因的表達，我們用半定量RT-PCR檢測了sRNA-Xcc3的過量表達菌株中候選靶標基因XC_0725的表達水平，以及sRNA-Xcc2的過量表達菌株和缺失突變體（將瑞萍博士之前構建）中候選靶標基因XC4321的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，XC4321在sRNA-Xcc2的過量表達菌株中的表達水平下降，在sRNA-Xcc2的缺失突變體中表達水平增加

8、，說明sRNA-Xcc2負調控XC_4321的表達。sRNA-Xcc3的過量表達對XC_0725的表達水平?jīng)]有影響，說明sRNA-Xcc3不參與XC_0725的表達調控。
　　本研究采用生物信息學預測結合凝膠阻滯實驗(EMSA)策略對4個Xcc小RNA的直接靶標進行了鑒定。雖然沒有鑒定到它們的直接靶標，但發(fā)現(xiàn)sRNA-Xcc2負調控XC_4321的表達。由于EMSA結果顯示sRNA-Xcc2不能與XC_4321mRNA結合，我們推