懸鈴木葉片體外植株再生系統(tǒng)及四倍體的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)反義LFY基因研究.pdf

1、懸鈴木樹(shù)干高大，綠化效果好，葉片吸塵、殺菌，抗有毒氣體和病蟲(chóng)害能力強(qiáng)，是世界著名的行道樹(shù)，有“行道樹(shù)之王”的美譽(yù)，因此，我國(guó)許多城市都有種植。但其果毛不僅污染環(huán)境，而且會(huì)引發(fā)呼吸系統(tǒng)及皮膚疾病，給居民的生活帶來(lái)了極大的不便。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾進(jìn)行了大量的研究工作，以期解決果毛污染問(wèn)題。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞工程和基因工程為解決這些問(wèn)題提供了新的途徑。 本試驗(yàn)首先利用細(xì)胞全能性原理誘導(dǎo)出了懸鈴木四倍體植株，然后研究了影響根癌農(nóng)桿

2、菌轉(zhuǎn)化懸鈴木的多種因素，優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件，建立了懸鈴木遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；篩選出了適宜懸鈴木組培苗葉片DNA的提取方法：利用GUS報(bào)告基因和PCR技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1. 在含不同濃度秋水仙素的MS+0．1 mg/L NAA+15 mg/L BA雙層培養(yǎng)基上進(jìn)行懸鈴木幼苗葉片細(xì)胞染色體加倍誘導(dǎo)試驗(yàn)，并通過(guò)變異植株根尖細(xì)胞染色體觀察和葉片單細(xì)胞DNA含量測(cè)定進(jìn)行倍性分析．結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)12d的懸鈴木葉片在秋水仙素濃度

3、為10 mg/L的雙層培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)處理24h時(shí)，四倍體誘導(dǎo)率最高達(dá)到23．4％．變異植株葉片比二倍體大，葉片長(zhǎng)寬比變小，葉片單個(gè)氣孔變大，氣孔密度變小． 2. 表達(dá)載體pBI121中整合了反義LEAFY基因，在反義LEAFY基因上有-HindⅢ酶切位點(diǎn)。通過(guò)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)其進(jìn)行酶切，切出了預(yù)期大小的DNA片段。將此質(zhì)粒用凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。PCR擴(kuò)增顯示反義LEAFY基因轉(zhuǎn)入

4、農(nóng)桿菌中。 3. 在幼芽生根和葉片分化培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為15 mg·L-1和40 mg·L-1Ka，根和葉片愈傷組織、幼芽的誘導(dǎo)率均為0；在分化和生根培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為500 mg·L-1和800 mg·L-1的Cef則可使愈傷組織、幼芽和根的誘導(dǎo)率為0。在葉片分化培養(yǎng)基中同時(shí)加入這2種抗生素，愈傷組織和幼芽誘導(dǎo)率為0的Ka+Cef組合的質(zhì)量濃度為30+400 mg·L-1。 4. 預(yù)培養(yǎng)9 d的懸鈴木葉

5、片在OD600值為0．7的根癌農(nóng)桿菌菌液中浸染10 min后，再在含有100pmol·L-1的乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上黑暗條件下共培養(yǎng)3d葉片的遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。該體系的建立為進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源目的基因培養(yǎng)懸鈴木新品種奠定了基礎(chǔ)。 5. 在DTT、PVP和AC 3種物質(zhì)中以0．08 mg·L-1的DTT抑制褐化最有效，褐化率為19％；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1％的AC次之，褐化率為27％；質(zhì)量濃度為2 000 mg·L-1的PVP褐化率

6、最高為48％。其它因素中，以10℃、光照強(qiáng)度為2 500 1x條件下褐化率達(dá)12％，效果最理想。 6. 在SDS-Ⅰ、SDS-Ⅱ、CTAB-Ⅰ和CTAB-Ⅱ提取葉片DNA的4種方法中，CTAB-Ⅱ法為DNA提取的最佳方法。 7. 含一定濃度Ka的選擇培養(yǎng)基對(duì)懸鈴木外植體進(jìn)行再生培養(yǎng)篩選，淘汰部分不具備Ka抗性的白化外植體。對(duì)篩選出的再生植株通過(guò)組織化學(xué)染色法檢測(cè)GUS活性，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株的組織中檢測(cè)到藍(lán)色。PCR特異擴(kuò)