高強(qiáng)度電脈沖促卵巢癌線粒體凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞、組織的生物學(xué)效應(yīng)越來越受到重視。低強(qiáng)度電脈沖導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，以此為依據(jù)的電化學(xué)療法和電基因轉(zhuǎn)染技術(shù)為腫瘤治療帶來希望；高強(qiáng)度電脈沖作用于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，細(xì)胞發(fā)生凋亡，這為惡性腫瘤殘余病灶的治療帶來希望。本實(shí)驗(yàn)組既往發(fā)現(xiàn)：能量可控電脈沖產(chǎn)生的高強(qiáng)度電場(chǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，腫瘤組織生長(zhǎng)受限、侵襲能力抑制，荷瘤動(dòng)物的生存期延長(zhǎng)。線粒體為能量供應(yīng)場(chǎng)地，也是凋亡發(fā)生的重要結(jié)構(gòu)，凋亡信號(hào)刺激線粒體膜通透性增加，線

2、粒體膜孔道(PTP)開放，釋放如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等凋亡蛋白，凋亡相關(guān)信號(hào)通道的激活，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以卵巢癌移植瘤為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過三部分的研究，分析出電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌線粒體變化的最佳劑量學(xué)水平，并對(duì)線粒體中相關(guān)凋亡蛋白及其凋亡信號(hào)通道上相關(guān)因子變化的檢測(cè)，分析線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，證實(shí)高強(qiáng)度電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌凋亡的線粒體機(jī)制。 第一部分能量可控電脈沖影響卵巢癌線粒體膜的劑量學(xué)研究 目的：通過檢測(cè)線

3、粒體膜PTP孔道的改變，分析對(duì)線粒體膜影響最大的脈沖參數(shù)組合，研究電脈沖對(duì)線粒體的作用的劑量學(xué)基礎(chǔ)，求證此參數(shù)組合電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為脈沖引起的線粒體凋亡的研究奠定劑量學(xué)依據(jù)。 材料與方法：以卵巢癌裸鼠皮下移植瘤為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)脈沖電場(chǎng)四因素三水平，脈沖電場(chǎng)作用于各實(shí)驗(yàn)組卵巢癌移植瘤，共聚焦顯微鏡檢測(cè)羅丹明123(Rh123)的染色程度分析電脈沖對(duì)線粒體膜PTP的變化，運(yùn)用最佳參數(shù)組合的脈沖電場(chǎng)作用于卵

4、巢癌組織，RT-PCR測(cè)定Bcl-2 mRNA的變化。 結(jié)果：在電脈沖參數(shù)中，電壓、頻率、脈寬顯著影響線粒體膜PTP的開放，作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)其無明顯影響(P＞0.05)；當(dāng)電壓為1000V、脈寬為250ns、頻率為1000Hz時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，脈沖電場(chǎng)對(duì)線粒體膜PTP影響最顯著。在此電場(chǎng)參數(shù)作用下，卵巢癌移植瘤Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降。 結(jié)論：不同參數(shù)組合的電脈沖對(duì)線粒體膜有不同強(qiáng)度的作用。高電壓

5、、高頻率可使線粒體膜PTP最大程度開放。然而并非脈寬越低，對(duì)線粒體膜PTP的影響越大；當(dāng)脈寬達(dá)到一定范圍內(nèi)，出現(xiàn)對(duì)線粒體膜最大程度的效應(yīng)。利用分析出的最大參數(shù)組合脈沖作用于卵巢癌，可降低凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)，提示電脈沖可誘導(dǎo)線粒體凋亡的發(fā)生，為脈沖的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分高強(qiáng)度電脈沖促卵巢癌線粒體凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的：證實(shí)高電壓、高頻率電脈沖可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡與影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如線粒體是否有必然的聯(lián)系

6、，研究高強(qiáng)度電脈沖是否影響了線粒體凋亡的途徑。 材料與方法：人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接種于裸鼠皮下建立腫瘤模型，數(shù)字隨機(jī)法分為實(shí)驗(yàn)組1-4和對(duì)照組，采用第一部分所得結(jié)果的高強(qiáng)度電脈沖作用于卵巢癌移植瘤。即刻行光電鏡觀察，與對(duì)照組對(duì)比分析細(xì)胞膜、細(xì)胞器及其內(nèi)容物、細(xì)胞核的改變。于脈沖作用后0h、6h、12h、24h取材，羅丹明123(Rh123)標(biāo)記卵巢癌組織內(nèi)線粒體膜，激光共聚焦測(cè)定線粒體PTP的變化；免疫組化和免疫熒光法檢

7、測(cè)細(xì)胞色素C(Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果：高強(qiáng)度電脈沖處理后，細(xì)胞形態(tài)保持完整，線粒體數(shù)量增加，細(xì)胞核膜破裂、異染色質(zhì)增多，凋亡小體增加。線粒體外膜通透性增加，PTP開放；高強(qiáng)度電脈沖作用后0h，AIF表達(dá)顯著增加，隨時(shí)間其強(qiáng)度有所降低，當(dāng)脈沖作用后12-24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)持續(xù)存在，其熒光強(qiáng)度值為別為86.15±2.05％、70.45±1.92％、62.35±2.56％、50.67±1.87％，較對(duì)

8、照組顯著升高；脈沖作用后0h，Cyt C表達(dá)高達(dá)89.05±2.35％；6h-12h后，表達(dá)的水平稍微降低，其熒光強(qiáng)度值為76.48±1.93％及57.62±2.08％，24h小時(shí)后表達(dá)細(xì)胞減少，其值為41.72±2.30％，仍高于對(duì)照組。 結(jié)論：高強(qiáng)度電脈沖作用后，卵巢癌細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量和功能發(fā)生改變，線粒體相關(guān)的凋亡蛋白釋放入細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)凋亡。線粒體凋亡途徑被激活，并能在脈沖處理后6-12小時(shí)持續(xù)發(fā)揮作用，提示高強(qiáng)度電脈沖

9、對(duì)凋亡信號(hào)途徑的調(diào)控作用，通過對(duì)線粒體凋亡功能的影響抑制卵巢癌的生長(zhǎng)與增殖，為高強(qiáng)度電脈沖治療腫瘤殘留提供了可能。 第三部分高強(qiáng)度電脈沖對(duì)線粒體凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)的影響 目的：通過對(duì)調(diào)控線粒體凋亡信號(hào)通路上相關(guān)分子的檢測(cè)，分析高強(qiáng)度電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌凋亡的可能線粒體途徑，明確高強(qiáng)度電脈沖產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)與線粒體改變的相關(guān)性。 材料與方法：人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接種于裸鼠皮下建立腫瘤模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1-4和對(duì)照組

10、，高強(qiáng)度電脈沖參數(shù)為第一部分實(shí)驗(yàn)所得，作用于實(shí)驗(yàn)組卵巢癌移植瘤。于脈沖處理后0h、6h、12h、24h取出標(biāo)本。免疫熒光法檢測(cè)電壓依賴陰離子通道(VDAC)的變化，F(xiàn)luo-3/AM探針標(biāo)記后激光共聚焦定位細(xì)胞內(nèi)外Ca2+分布，熒光分光光度計(jì)測(cè)量Ca2+含量變化，RT-PCR測(cè)定bcl-2、bax的mRNA水平。與對(duì)照組比較其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：高強(qiáng)度電脈沖作用0h后，實(shí)驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞VDAC表達(dá)顯著下降至17.99±1.15，

11、與對(duì)照組46.14±1.55比較，差異顯著；Ca2+向線粒體聚積，其含量明顯增加，達(dá)16.50±1.08，與對(duì)照組6.40±1.51比較，有顯著性差異。VDAC表達(dá)呈下降趨勢(shì)，于脈沖作用后6h、12h、24h，熒光強(qiáng)度分別為5.85±1.19、6.10±1.31、3.80±0.53.Ca2+含量在脈沖作用后6h，亦呈下降趨勢(shì)，12h后，其含量低于對(duì)照組，24h后Ca2+在線粒體內(nèi)聚積趨于消失。bcl-2在高強(qiáng)度電脈沖作用后mRNA顯著下

12、調(diào)，其相對(duì)灰度值為0.15，而對(duì)照組mRNA的灰度值維持于0.48，脈沖處理后bax表達(dá)增加，其灰度相對(duì)值為0.69，而維持于脈沖處理后24h內(nèi)，同對(duì)照組比較，有顯著性差異。 結(jié)論：高強(qiáng)度電陡脈沖作為一種強(qiáng)的外昴刺激信號(hào)，作用于線粒體外膜VDAC，使線粒體通透性下降，信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，第二信號(hào)Ca2+的分布和含量發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，同時(shí)bcl-2的表達(dá)下降，bax表達(dá)增加，Bcl-2家族凋亡基因的表達(dá)波動(dòng)，增強(qiáng)了凋亡信號(hào)在細(xì)胞