脂聯(lián)素在小鼠急性肝損傷的表達及作用的實驗研究.pdf

1、目的：本文采用ConA誘導(dǎo)小鼠制造急性肝損傷模型，應(yīng)用脂聯(lián)素干預(yù)實驗全面、系統(tǒng)地探討了脂聯(lián)素對急性肝損傷的保護機制，包括脂聯(lián)素對TNF-α、白介素-10(interleukin-10，IL-10)等多種炎癥細胞因子的影響：脂聯(lián)素對肝細聯(lián)素是機體產(chǎn)生的一種生理性的脂肪因子，研究脂聯(lián)素對急性肝損傷的保護作用，可為脂聯(lián)素應(yīng)用于肝炎的臨床治療提供理論依據(jù)，為病毒性肝炎等肝損傷的治療提供一條安全、有效的新途徑。 方法: 1. 急性

2、肝損傷模型的建立及脂聯(lián)素的表達 健康雄性BALB/c小鼠21只，4周齡，體重20±3g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。用標準飼料喂養(yǎng)一周后，用隨機數(shù)字表隨機分為3組。ConA組8只：ConA 30mg/kg尾靜脈注射。對照組8只：尾靜脈注射生理鹽水10ml/kg。脂聯(lián)素組5只：在靜脈注射ConA前12小時和2小時前，分別應(yīng)用脂聯(lián)素3mg/kg腹膜內(nèi)注射(其余兩組同時給與相當毫升的生理鹽水腹膜內(nèi)注射)。實驗小鼠在注射ConA前12

3、小時開始禁食。 注射ConA后8小時股動脈放血處死小鼠，離心血液留取血清，-20℃冰箱保存，用于血清學(xué)檢測；取部分肝組織立即10％的福爾馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明浸蠟后，將標本石蠟包埋制成蠟塊后聯(lián)續(xù)切片，用于免疫組化檢測或常規(guī)蘇木素.伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，進行普通病理學(xué)觀察；部分肝組織液氮冷凍，存于-80℃冰箱用于mRNA檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(enzyme linked immun

4、osorbent assay。ELISA)檢測血清脂聯(lián)素水平；采用免疫組化法檢測肝組織脂聯(lián)素蛋白的表達；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測肝組織脂聯(lián)素mRNA的表達。 2. 脂聯(lián)素對Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷細胞因子的調(diào)節(jié)作用 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標本的制備同第一部分。本研究檢測了各組小鼠細胞因子的血清水平及部分細

5、胞因子mRNA在肝組織的表達。采用速率法測定各組小鼠ALT的血清水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝組織TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表達。 3. 脂聯(lián)素對急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標本的制備同第一部分。脂聯(lián)素對ConA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡是促進還是抑制?本文采用TdT介導(dǎo)的脫氧核苷酸

6、切口末端標記法(TdT-mediated x-dUTP nick end labeling，TUNEL)原位檢測各組小鼠肝細胞凋亡的形態(tài)特征和分布，并應(yīng)用流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測肝細胞凋亡及細胞增殖周期。 4. 脂聯(lián)素抗炎作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的初步探討 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標本的制備同第一部分。脂聯(lián)素發(fā)揮抗炎作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制目前尚不明確，本文采用免疫組化法檢測了各組小鼠肝組織cAMP依賴的蛋白

7、激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)蛋白的表達；RT-PCR法檢測肝組織PKA mRNA和P13K mRNA表達；NF-κB活性的檢測采用凝膠電泳遷移率改變分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。 結(jié)果: 1. 急性肝損傷模型的建立及脂聯(lián)

8、素的表達 ①普通病理觀察光鏡下，對照組小鼠肝組織無炎癥細胞浸潤。ConA組可見肝內(nèi)大量T淋巴細胞浸潤，在匯管區(qū)尤為明顯，肝竇內(nèi)紅細胞淤積，中央靜脈周圍肝細胞水腫明顯，可見點、灶狀壞死區(qū)。脂聯(lián)素組肝組織炎癥細胞浸潤明顯減輕，無明顯淤血，肝細胞輕度水腫。②血清脂聯(lián)素的檢測結(jié)果：脂聯(lián)素組血漿脂聯(lián)素水平(15.4±3.0μg/ml)與對照組(16.5±2.8μg/ml)比較無差異(P>0.05)，與ConA組(11.8±2.1μg/ml

9、)比較明顯升高(P<0.05)。ConA組與對照組比較顯著降低(P<0.05)。③肝組織脂聯(lián)素蛋白的表達：對照組小鼠肝組織脂聯(lián)素蛋白少量表達在中央靜脈內(nèi)皮細胞。ConA組肝組織脂聯(lián)素蛋白表達明顯增強，尤以炎癥細胞浸潤區(qū)為著。脂聯(lián)素組表達輕度增強，見于炎癥細胞浸潤區(qū)及部分肝竇內(nèi)皮細胞。統(tǒng)計分析顯示：脂聯(lián)素組脂聯(lián)素蛋白表達(5.39±1.72％)與對照組(1.82±0.36％)比較表達增強(p<0.05)，與ConA組(10.63±4.35

10、％)比較表達下降(p<0.01)；ConA組脂聯(lián)素蛋白表達與對照組比較明顯增強(p<0.01)。④肝組織脂聯(lián)素mRNA的表達：對照組小鼠肝組織即可檢測到少量脂聯(lián)素tuRNA表達，脂聯(lián)素組和ConA組表達均增強。統(tǒng)計分析示：脂聯(lián)素組脂聯(lián)素mRNA表達(0.46±0.17)與對照組(0.23±0.05)比較表達增強(p<0.05)，與ConA組(0.51±0.21)比較表達無差異(p>0.05)；ConA組脂聯(lián)素mRNA表達與對照組比較明顯

11、增強(p<0.01)。 2. 脂聯(lián)素對Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷細胞因子的調(diào)節(jié)作用 ①各組小鼠血清ALT水平：對照組血清ALT水平(44.71±21.29U/L)最低，其次為脂聯(lián)素組(192.50±45.87U/L)，Con A組ALT水平最高(616.00±171.50 U/L)；統(tǒng)計分析示：脂聯(lián)素組血清ALT水平與對照組比較明顯升高(p<0.05)，與ConA組比較明顯下降(p<0.01)；ConA組與對照組比較明顯

12、升高(p<0.01)。②各組小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的變化：對照組、脂聯(lián)素組和Con A組血清TNF-α水平分別為：0.06±0.04 ng/ml，0.51±0.29 ng/ml，0.92±0.37 ng/ml；IL-10血清水平分別為：O.09±0.06 ng/ml，0.54±0.17 ng/ml，0.26±0.11 ng/ml；IL-4血清水平分別為0.08±0.03 ng/ml，0.27±0.11 ng

13、/ml，0.69±0.25 ng/ml；INF-γ血清水平分別為：0.71±0.28 ng/ml，2.24±0.46 ng/ml，2.97±0.61 ng/ml；對照組4種細胞因子水平均低于脂聯(lián)素組和ConA組，脂聯(lián)素組IL-10血清水平高于Con A組(p<0.05)，其余3種細胞因子均低于Con A組。⑧相關(guān)分析顯示：血清ALT水平分別與血清TNF-α、IL-4、INF-γ水平呈正相關(guān)(r：0.738p<0.01；r：0.693 p

14、<0.01；r：0.637 p<0.01)。④肝組織TNF-α mRNA的表達：對照組微量表達(0.13±0.07)，Con A組表達(0.82±0.27)較對照組明顯增強(p<0.01)，脂聯(lián)素組表達(0.51±0.19)較對照組增強(p<0.01)；脂聯(lián)素組較Con A組表達下降(p<0.05)⑤肝組織IL-10 mRNA的表達：對照組微量表達(0.21±0.11)，脂聯(lián)素組(0.74±0.27)較對照組表達明顯增強(p<0.01)

15、；Con A組(0.43±0.19)較對照組表達增強(p<0.05)，脂聯(lián)素組較Con A組表達增強(p<0.05)。 3. 脂聯(lián)素對急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響 4 脂聯(lián)素抗炎作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的初步探討 結(jié)論: 1.小鼠靜脈注射ConA可導(dǎo)致肝臟急性炎癥，血清脂聯(lián)素水平降低，這與注射ConA后產(chǎn)生的大量炎癥細胞因子抑制脂肪組織分泌脂聯(lián)素有關(guān)。但肝組織脂聯(lián)素蛋白及其mRNA的表達增強，這與肝組織內(nèi)炎癥

16、細胞的浸潤及機體所產(chǎn)生的抗炎機制有關(guān)。如靜脈注射ConA前補充外源性脂聯(lián)素，可明顯減輕炎癥，表明脂聯(lián)素可減輕ConA誘導(dǎo)的肝組織炎癥程度，但對其mRNA在肝組織的表達無明顯影響。 2. 小鼠靜脈注射ConA可升高血清ALT以及IL-4、TNF-α、IL-10和IFN-γ多種細胞因子血清水平。預(yù)先應(yīng)用重組脂聯(lián)素干預(yù)可降低ALT血清水平以及促炎細胞因子IL-4、TNF-α和IFN-γ的血清水平，但升高抗炎因子IL-10的血清水平及其

17、在肝臟的表達，即脂聯(lián)素通過促進抗炎因子、抑制促炎因子的產(chǎn)生來降低升高的血清ALT水平。 3. 注射ConA可誘導(dǎo)小鼠肝細胞凋亡并抑制肝細胞再生。脂聯(lián)素可改善ConA對肝細胞增殖的抑制作用并明顯降低肝細胞的凋亡率，從而起到保護肝細胞的作用。 4. 注射ConA后小鼠肝組織P13K和PKA蛋白表達以及NF-κB的結(jié)合活性增強，補充外源性脂聯(lián)素可進一步增強P13K的蛋白及mRNA的表達，降低NF-κB的活性，而PKA表達無變化