RNA沉默抑制子p25在瞬時(shí)表達(dá)體系中的沉默抑制作用及其抗血清制備.pdf

1、RNA沉默(RNA silencing)是一種依賴(lài)核酸序列特異性的抗病毒防御機(jī)制。而針對(duì)寄主的這一防御機(jī)制，許多病毒演化出相應(yīng)的克服抗性的RNA沉默抑制子。利用農(nóng)卡T菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系表達(dá)外源蛋白時(shí)，往往在侵染2-3天后外源蛋白表達(dá)水平就開(kāi)始下降，實(shí)際上，轉(zhuǎn)錄后基因沉默即RNA沉默是導(dǎo)致無(wú)效性的主要原因，因此利用農(nóng)桿菌共同轉(zhuǎn)化RNA沉默抑制子基因和目的基因?qū)⑻岣吣康牡鞍椎谋磉_(dá)水平。本研究中，將PVX編碼的p25及TBSV編碼的p19兩

2、種抑制子分別和迷迭香酸合成途徑中的關(guān)鍵酶之一--羥基苯丙酮酸酯還原酶(HPPR)基因共侵染，分析RNA沉默抑制子對(duì)瞬時(shí)表達(dá)引起的基因沉默的抑制作用，并初步探討了彩葉草葉片中瞬時(shí)表達(dá)的HPPR對(duì)迷迭香酸合成代謝的影響。具體結(jié)果如下。 1.用攜帶HPPR基因的農(nóng)桿菌侵染本生煙，侵染后第3天HPPR蛋白的表達(dá)量最高，以后逐漸降低，到第8天時(shí)表達(dá)量幾乎檢測(cè)不到。而當(dāng)HPPR基因農(nóng)桿菌與沉默抑制子基因農(nóng)桿菌混合侵染時(shí)，HPPR的表達(dá)量較單

3、獨(dú)侵染有明顯提高。侵染后第5天，p25引起HPPR表達(dá)量增加3-5倍，p19則可引起HPPR蛋白表達(dá)增加10倍。到侵染后第8天，有抑制子存在的情況下，HPPR仍有表達(dá)，且p19對(duì)HPPR表達(dá)增強(qiáng)作用更明顯。 2.HPLC分析表明，用攜帶HPPR基因的農(nóng)桿菌侵染彩葉草時(shí)，侵染后第三天迷迭香酸含量達(dá)到最高(干重的2.7％)，而侵染5-8天后，含量逐漸降低，第8天時(shí)與未經(jīng)處理的彩葉草迷迭香酸含量(干重的0.946％)基本一致。當(dāng)攜帶有

4、HPPR和p25基因的農(nóng)桿菌共侵染彩葉草時(shí)，迷迭香酸的含量在侵染后3、5、8天分別為干重的4.05％、5.56％、2.83％。當(dāng)攜帶有HPPR和p19基因的農(nóng)桿菌共侵染彩葉草時(shí)，迷迭香酸的含量在侵染后3、5、8天分別為干重的6.75％、7.65％、4.78％。結(jié)合western blot和HPLC結(jié)果我們可以看出，HPPR蛋白表達(dá)水平能明顯地影響迷迭香酸含量，兩者大致呈正相關(guān)，當(dāng)HPPR蛋白表達(dá)量高時(shí)，迷迭香酸的含量相應(yīng)的就高，最高可達(dá)