金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　為了探討金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)建立免疫抑制小鼠模型，觀察金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官、抗應(yīng)激能力、抗自由基水平和免疫細(xì)胞功能等方面的影響，并進(jìn)行作用機(jī)制研究，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法
　　1 SPF級(jí)昆明種小鼠60只，14～18g，隨機(jī)分為六組，分別為:正常對(duì)照組（生理鹽水灌胃0.2mL/10g，連續(xù)10天）;環(huán)磷酰胺組（生理鹽水灌胃0.2mL/10g，連續(xù)10天，同時(shí)

2、隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg/kg）;陽(yáng)性對(duì)照組（每天灌胃左旋咪唑劑25 mg/kg，連續(xù)10天，給藥后隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg/kg）;金黃扶正茶高、中、低劑量組（每天分別灌胃金黃扶正茶5.08g/kg、2.54g/kg、1.27 g/kg，連續(xù)10天，給藥后隔天皮下注射環(huán)磷酰胺30mg/kg），建立免疫功能低下小鼠模型。末次給藥后小鼠禁食12h，處死，分別取胸腺，脾臟稱重，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。將脾臟制成組織勻漿，離心，取上清，進(jìn)

3、行乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定和酸性磷酸酶(ACP)活性測(cè)定。
　　2造模及給藥方法同1，分別進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、耐高溫實(shí)驗(yàn)、耐低溫實(shí)驗(yàn)、常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)和亞硝酸鹽中毒性耐缺氧實(shí)驗(yàn)。游泳實(shí)驗(yàn)觀察其游泳時(shí)間，其余各實(shí)驗(yàn)觀察存活時(shí)間。
　　3造模及給藥方法同1，取小鼠脾臟制成組織勻漿，離心，取上清，測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)。<

4、br>　　4造模及給藥方法同1，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法，測(cè)定刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)脾臟T淋巴細(xì)胞增殖和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖的影響，測(cè)定自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK細(xì)胞）活性，檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。
　　5造模及給藥方法同1.1，末次用藥后小鼠禁食12h，各組小鼠尾靜脈取血1mL，離心，取血清備用，采用細(xì)胞因子抗體芯片進(jìn)行細(xì)胞因子定量檢

5、測(cè)。
　　6造模及給藥方法同1.1，小鼠處死后，取脾，立即置液氮中，隨后轉(zhuǎn)移置-80℃低溫冰箱保存，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測(cè)脾臟T-bet、GATAmRNA的表達(dá)。
　　7造模及給藥方法同1.1，小鼠處死后，取脾，4％多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，采用TUNEL染色法觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　8采用FQ-PCR方法檢測(cè)脾臟Bcl-2、Bax、Fas和FasL mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)

6、果
　　1與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，給藥后，金黃扶正散中、高劑量組可顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)(P＜0.01，P＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組可明顯降低LDH、ACP的活性(P＜0.01);給藥后，金黃扶正散低、中、高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠的LDH活性和ACP活性(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組負(fù)重游泳時(shí)間明顯減

7、少(P＜0.05)，耐高溫存活時(shí)間明顯減少(P＜0.01)，耐低溫存活時(shí)間明顯減少(P＜0.01)，在常壓缺氧條件下的存活時(shí)間明顯減少(P＜0.01)，亞硝酸鹽中毒性缺氧狀態(tài)下存活時(shí)間明顯減少(P＜0.01);給藥后與模型組比較，金黃扶正散中、高劑量組能明顯延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間(P＜0.05)，金黃扶正散低、中劑量組能明顯延長(zhǎng)耐高溫存活時(shí)間(P＜0.01)，金黃扶正散低、中劑量組可顯著提高小鼠的耐低溫存活時(shí)間(P＜0.05)，金黃扶正散低、

8、高劑量組能明顯延長(zhǎng)常壓耐缺氧存活時(shí)間(P＜0.01)，金黃茶中劑量組能明顯延長(zhǎng)亞硝酸鹽中毒性缺氧存活時(shí)間(P＜0.01)。
　　3與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組可顯著降低T-AOC能力(P＜0.01)，降低CAT、SOD、GSH-PX的活性(P＜0.05，P＜0.01);明顯提高M(jìn)DA含量(P＜0.05)。給藥后，金黃扶正散中、高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠的T-AOC能力(P＜0.01);金黃扶正散高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠的

9、CAT、SOD、GSH-PX的活性(P＜0.05，P＜0.01);金黃扶正散中、高劑量組可明顯降低免疫抑制小鼠的MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)。
　　4與環(huán)磷酰胺組比較，金黃扶正散低、中、高劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的T、B淋巴細(xì)胞增殖能力(P＜0.01);金黃扶正散中、高劑量組能顯著提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞活性(P＜0.01，P＜0.05);金黃扶正散高劑量組能顯著性提高免疫抑制小鼠的CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)

10、(P＜0.05)，金黃扶正散中、高劑量組能顯著性提高免疫抑制小鼠的CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)(P＜0.01)，金黃扶正散低、中、高劑量組降低CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)和提高CD4+/CD8+比值(P＜0.01，P＜0.05);金黃扶正散中、高劑量組可提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力(P＜0.05);金黃扶正散低、中、高劑量組可提高巨噬細(xì)胞iNOS活性(P＜0.01，P＜0.05)。
　　5與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組的2種細(xì)胞因子IFN-γ和RANTES

11、呈顯著性降低(P＜0.05)，金黃扶正散低、中、高劑量組給藥后IFN-γ有顯著性提升，高劑量組的RANTES呈顯著性升高(P＜0.05);與對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組的5種細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和MCP-1呈顯著性升高(P＜0.01，P＜0.05)，給藥組給藥后有不同程度降低(P＜0.01，P＜0.05);13種細(xì)胞因子GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL

12、-17、M-CSF、TNF-α、KC和VEGF無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　6與環(huán)磷酰胺組比較，金黃扶正散低、中、高劑量組的T-bet mRNA表達(dá)量呈顯著性提高而GATAmRNA表達(dá)量呈顯著性降低(P＜0.01)。
　　7與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組凋亡指數(shù)顯著性提高(P＜0.05);金黃扶正散中、高劑量組凋亡指數(shù)與環(huán)磷酰胺組比較顯著性下降(P＜0.01，P＜0.05)。金黃扶正散低劑量凋亡指數(shù)與環(huán)磷酰胺組比較無(wú)顯著差

13、異(P＞0.05)。
　　8與環(huán)磷酰胺組比較，金黃扶正散中、高劑量組的bcl-2 mRNA表達(dá)量呈顯著性提高(P＜0.01)，bcl-2/bax mRNA比值呈顯著性降低(P＜0.01，P＜0.05)。與環(huán)磷酰胺組比較，金黃扶正散中、高劑量組的Fas和FasL mRNA表達(dá)量均呈顯著性降低(P＜0.01，P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1采用免疫抑制劑環(huán)磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型，造模后小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)下降，金黃

14、扶正散可提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，提高免疫抑制小鼠的LDH和ACP活性，激活巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)。
　　2金黃扶正散可延長(zhǎng)免疫抑制小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，提高其耐高溫、低溫、常壓耐缺氧、亞硝酸鹽中毒性缺氧的存活時(shí)間，提高免疫抑制小鼠抗應(yīng)激的能力。
　　3金黃扶正散可顯著提高免疫抑制小鼠CAT、T-SOD、GSH-PX的活性，顯著提高T-AOC能力，明顯降低MDA含量，調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶的水平和自由基水平，改善機(jī)體的氧化還原

15、狀態(tài)。
　　4金黃扶正散能顯著提高免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖能力;提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞殺傷活性;提高免疫抑制小鼠外周血CD3+和CD4+/CD8+比值;提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性及iNOS活力，從而提高免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能。
　　5小鼠血清中細(xì)胞因子的變化提示，免疫抑制小鼠的Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞偏移，Th1/Th2亞群失衡，金黃扶正散對(duì)免疫抑制小鼠Th1/Th2亞群的調(diào)節(jié)，可