基于血管細(xì)胞黏附分子-1單鏈抗體的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分子影像的前期實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：對(duì)ApoE基因敲除小鼠進(jìn)行粥樣硬化造模，并驗(yàn)證造模是否成功。從噬菌體重組抗體庫中篩選獲得靶向Vcam-1的單鏈抗體，鑒定其親和性并與單克隆抗體效價(jià)進(jìn)行比較。
　　方法：9周齡ApoE基因敲除小鼠用D12108C高脂飼料喂養(yǎng)4個(gè)月后取3只以18F-FDG小動(dòng)物PET顯示動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊的炎癥病變，并取其動(dòng)脈組織用western blotting、病理切片及免疫組化顯示粥樣斑塊存在及斑塊內(nèi)Vcam-1分子表達(dá)情況，另設(shè)3只普通C5

2、7BL/6小鼠作為對(duì)照。擴(kuò)增Vcam-1基因克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中表達(dá)獲得Vcam-1抗原蛋白，純化后用該蛋白包被免疫管，通過四輪壓力逐漸增大的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程篩選獲得陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)，選取效價(jià)高的克隆送予測(cè)序并轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，認(rèn)定高表達(dá)的樣品為最終的陽性克隆。將最終的陽性克隆轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)單鏈抗體，純化的單鏈抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)并評(píng)價(jià)其抗原親和性。
　　結(jié)果：造模小鼠尾靜脈注射18F-

3、FDG一小時(shí)后行小動(dòng)物PET顯像，主動(dòng)脈部位可見顯像劑濃聚，與正常小鼠對(duì)比明顯。HE切片可見動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊組織，western blotting檢測(cè)顯示粥樣硬化動(dòng)脈組織內(nèi)有Vcam-1分子表達(dá)，組化切片定位Vcam-1分子主要在斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞上。真核細(xì)胞表達(dá)的Vcam-1抗原蛋白的分子量為85-90kDa，以Vcam-1抗原蛋白為免疫原篩選四輪所得的陽性克隆進(jìn)行單噬菌體ELISA檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果中選取9個(gè)效價(jià)高的克隆經(jīng)基因測(cè)序共獲得3個(gè)