細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶11(CDK11)在脂肪肉瘤細(xì)胞生長中的重要作用.pdf

1、脂肪肉瘤是成人較常見的一類軟組織腫瘤，其發(fā)病率居軟組織肉瘤的第二位。最常發(fā)生于下肢和腹膜后等部位，也可發(fā)生在肝臟。手術(shù)切除是治療脂肪肉瘤的主要方式，近三十年來在改善復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性脂肪肉瘤的存活率上未取得重大進(jìn)展?？梢?，迫切需要制訂新的治療方案來改善患者的預(yù)后，尋找新的靶向療法將成為提高脂肪肉瘤患者生存率的關(guān)鍵，分子生物學(xué)上的新發(fā)現(xiàn)可能為脂肪肉瘤的治療打開嶄新的大門。
　　致癌蛋白激酶和其特異性的小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)徹底革新了癌癥治療

2、的理念。對(duì)蛋白激酶在腫瘤細(xì)胞中的功能和作為藥物靶點(diǎn)的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，在過去的十年中，已證明蛋白激酶靶向療法可有效地治療多種癌癥。已有研究發(fā)現(xiàn)在脂肪肉瘤中幾種蛋白激酶過表達(dá)或者表達(dá)上調(diào)，然而，大多數(shù)蛋白激酶在脂肪肉瘤細(xì)胞生長中的作用仍然是未知的，脂肪肉瘤中其它高表達(dá)和活化的蛋白激酶能否以類似的方式作為藥物靶向治療的靶點(diǎn)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來研究。
　　作為一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是細(xì)胞周期

3、調(diào)控中的重要因子，和周期蛋白(cyclin)協(xié)同作用，在細(xì)胞生長、增殖和凋亡中起重要調(diào)控作用，因此CDKs抑制劑能否作為一種新的抗癌藥物已受到廣大學(xué)者的關(guān)注。目前，盡管CDKs抑制劑未被批準(zhǔn)作為一種抗癌藥物，但是據(jù)報(bào)道已有幾種CDKs抑制劑進(jìn)入治療各種癌癥的臨床試驗(yàn)。這些正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)將促進(jìn)更多有潛力的以CDKs為基礎(chǔ)的抗癌藥物的出現(xiàn)。
　　CDK11（又名PITSLRE或CDC2L1）是p34cdc2相關(guān)激酶家族的一個(gè)成員。

4、真核細(xì)胞中至少有10種CDK11亞型，有報(bào)道指出CDK11的功能與轉(zhuǎn)錄和RNA剪切有關(guān)。CDK11在各種腫瘤細(xì)胞系廣泛表達(dá)并貫穿細(xì)胞周期各個(gè)階段。在本課題組的前期研究中，我們通過人類多種蛋白激酶的shRNA慢病毒載體在骨肉瘤細(xì)胞株中對(duì)靶向激酶基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)CDK11基因表達(dá)水平的下調(diào)有抑制細(xì)胞生長的效應(yīng)。前期研究結(jié)果還顯示在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中CDK11基因下調(diào)均可導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞生長受到抑制，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其在脂肪肉瘤細(xì)胞中的作

5、用仍然未知。
　　為了探討CDK11對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞的生長有無調(diào)控作用，本課題分為三部分進(jìn)行研究，首先通過組織芯片與免疫組化技術(shù)相結(jié)合來比較CDK11在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中的表達(dá)情況有無差異，并評(píng)估CDK11的表達(dá)水平和脂肪肉瘤患者預(yù)后之間有無聯(lián)系，初步評(píng)價(jià)脂肪肉瘤組織中CDK11異常表達(dá)的臨床意義。此外，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)CDK11在脂肪肉瘤細(xì)胞生長和增殖中的調(diào)控作用進(jìn)行評(píng)估，探討其異常表達(dá)與脂肪肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，并對(duì)

6、其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。最后進(jìn)一步分析研究脂肪肉瘤細(xì)胞中CDK11蛋白表達(dá)水平的下調(diào)對(duì)化療藥物毒性作用的影響，分析CDK11 siRNA與多柔比星兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　第一部分 CDK11在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中的表達(dá)差異及意義
　　背景及目的
　　蛋白激酶在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞功能方面扮演了重要的角色，其在多種癌癥中往往又是高表達(dá)或者處于活化狀態(tài)，因此它們成為可以引起癌癥發(fā)生的致癌基因，已證明蛋白激酶靶向

7、療法可有效地治療多種癌癥。為了研究CDK11對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞的生長有無類似其它蛋白激酶的那種調(diào)控作用，首先需要驗(yàn)證CDK11在脂肪肉瘤組織中的表達(dá)水平是否高表達(dá)，在本課題中，以脂肪瘤作為對(duì)照組，比較CDK11在脂肪肉瘤和良性脂肪瘤中表達(dá)水平的差異，并評(píng)估CDK11的表達(dá)水平與脂肪肉瘤患者的預(yù)后之間的關(guān)系，初步探討脂肪肉瘤組織中CDK11異常表達(dá)的臨床意義。
　　研究方法
　　1.為了比較CDK11在良性脂肪瘤和脂肪肉瘤組織中的

8、表達(dá)差異，通過免疫組織化學(xué)方法分析脂肪瘤和脂肪肉瘤組織芯片中CDK11的表達(dá)含量及其定位。
　　2.對(duì)組織芯片中高表達(dá)和低表達(dá)CDK11患者的生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，并對(duì)脂肪肉瘤組織中死亡組和存活組CDK11的表達(dá)水平進(jìn)行比較，以評(píng)估CDK11的表達(dá)水平與脂肪肉瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　結(jié)果
　　1.脂肪肉瘤組織中的CDK11蛋白表達(dá)水平(2.6±0.20)明顯高于脂肪瘤組織（0.56±0.18

9、）。高表達(dá)的CDK11（CDK11評(píng)分≥3）可見于58.5％的脂肪肉瘤，而脂肪瘤組織未見高表達(dá)的CDK11，這提示CDK11在脂肪肉瘤的生長中可能發(fā)揮著重要作用。此外，在41個(gè)脂肪肉瘤樣本中，38(92.7％)個(gè)樣本表現(xiàn)為CDK11陽性，然而在脂肪瘤中，這一比例為55.6％。結(jié)果還表明，CDK11蛋白質(zhì)主要定位在脂肪肉瘤細(xì)胞核。
　　2.通過Kaplan-Meier生存分析，脂肪瘤和脂肪肉瘤組之間的生存時(shí)間有明顯差異，但是CDK1

10、1的表達(dá)水平與脂肪肉瘤患者的生存時(shí)間無明顯關(guān)系，脂肪肉瘤組織中CDK11高表達(dá)組(≥3)和低表達(dá)組（≤2）兩組生存時(shí)間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將41例脂肪肉瘤組織分為死亡組和存活組，t檢驗(yàn)比較兩組之間的CDK11的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK11的表達(dá)水平在兩組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。這些結(jié)果均表明CDK11的表達(dá)水平與脂肪肉瘤患者的預(yù)后無明顯關(guān)系。
　　結(jié)論
　　1.脂肪肉瘤組織中的CDK11蛋白表達(dá)水平明顯高

11、于脂肪瘤組織，本研究證實(shí)CDK11在脂肪肉瘤組織中高表達(dá)，這提示CDK11在脂肪肉瘤的生長增殖中發(fā)揮重要作用，并參與脂肪肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.在CDK11高表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性研究中并未得到與其它蛋白激酶相一致的結(jié)果，CDK11的高表達(dá)與脂肪肉瘤患者的預(yù)后無明顯關(guān)系，這可能與組織芯片中脂肪肉瘤患者的樣本量較少有關(guān)，需增加實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)進(jìn)一步進(jìn)行研究和分析。
　　第二部分 CDK11在脂肪肉瘤細(xì)胞生長中的調(diào)控作用及其機(jī)制

12、r>　　背景及目的
　　作為一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子，和周期蛋白(cyclin)協(xié)同作用，在細(xì)胞生長、增殖和凋亡中起重要調(diào)控作用。本部分中，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)CDK11在脂肪肉瘤細(xì)胞生長和增殖中的調(diào)控作用進(jìn)行評(píng)估，探討其異常表達(dá)與脂肪肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　研究方法
　　1.為了評(píng)估CDK11在脂肪肉瘤細(xì)胞生長中

13、的功能，體外培養(yǎng)兩種脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872和SW982，人工合成的CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染脂肪肉瘤細(xì)胞并觀察細(xì)胞的生長和增殖能力，非特異siRNA作為陰性對(duì)照。最終細(xì)胞的存活能力用MTT的方法來檢測，Western blotting來驗(yàn)證CDK11 siRNA的干擾效率。
　　2.為進(jìn)一步分析CDK11基因下調(diào)對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞生長的長期影響，五個(gè)不同序列的CDK11 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪肉瘤細(xì)胞SW982并觀察細(xì)胞的生長

14、和增殖能力。CDK11 shRNA慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染脂肪肉瘤細(xì)胞株建成后，收集所有細(xì)胞并計(jì)數(shù)以此來分析細(xì)胞的增殖能力。
　　3.通過細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)估CDK11對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞生長的影響和CDK11的細(xì)胞定位。
　　4.為研究CDK11抑制腫瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制，CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染脂肪肉瘤細(xì)胞后用Western blotting來分析多種凋亡相關(guān)蛋白(MCL-1、Bcl-XL、Bax、Survivin、Cyt

15、ochrome C和Cyclin D1)，并通過軟件Odyssey3.0來進(jìn)行蛋白相對(duì)表達(dá)定量分析。
　　結(jié)果
　　1.40 nmol/L的CDK11 siRNA以時(shí)間依賴性的方式明顯抑制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長和增殖，伴隨著CDK11蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。另外，CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染脂肪肉瘤細(xì)胞后，還以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞的生長和增殖。Westernblotting證實(shí)CDK11 siRNA對(duì)細(xì)胞呈劑量依賴性的生長抑制伴

16、隨著CDK11蛋白表達(dá)水平的逐漸降低。
　　2.與正常對(duì)照組、非特異shRNA慢病毒載體和空載轉(zhuǎn)染組相比，CDK11shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染可顯著降低脂肪肉瘤的細(xì)胞生長和增殖能力。結(jié)果表明，CDK11 shRNA(TRCN0000006208)對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞生長的抑制率為66.7％，而其它四種CDK11 shRNA的抑制率高達(dá)90-100％。
　　3.與脂肪肉瘤組織芯片的結(jié)果一致，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果同樣顯示，CDK11蛋白主要

17、定位于脂肪肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞核。與正常對(duì)照組和非特異siRNA轉(zhuǎn)染組相比，CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染組中的脂肪肉瘤細(xì)胞CDK11（綠色熒光）的表達(dá)水平下降，而且細(xì)胞的生長和增殖受到抑制（CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染組中紅色熒光內(nèi)參蛋白和藍(lán)色熒光細(xì)胞核明顯減弱）。
　　4.脂肪肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDK11 siRNA后CDK11蛋白表達(dá)水平下降，同時(shí)伴有兩個(gè)抗凋亡相關(guān)蛋白(Cyclin D1和Survivin)表達(dá)水平明顯降低。此外，另外一種抗

18、凋亡相關(guān)蛋白Cytochrome C在CDK11 siRNA轉(zhuǎn)染SW872細(xì)胞后表達(dá)水平也下降。以上結(jié)果表明，CDK11基因下調(diào)對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞生長的抑制作用是通過下調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和Survivin來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論
　　1.為了評(píng)估CDK11在脂肪肉瘤細(xì)胞生長中的調(diào)控作用，人工合成的CDK11 siRNA和CDK11 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染兩種脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872和SW982中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK11

19、基因下調(diào)可明顯抑制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長和增殖，這些結(jié)果均證實(shí)CDK11在惡性脂肪肉瘤的生長增殖過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　2.在CDK11抑制腫瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，CDK11基因下調(diào)對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞生長的抑制作用是通過下調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和Survivin表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。換言之，CDK11基因通過促進(jìn)抗凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和Survivin表達(dá)來抑制凋亡，從而參與了脂肪肉瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展以及生

20、長增殖過程。
　　3.CDK11對(duì)脂肪肉瘤來說是一個(gè)很有前途的治療靶點(diǎn)，有望成為脂肪肉瘤基因治療的候選靶點(diǎn)，CDK11抑制劑可能是一種有潛力的新型抗癌藥物。
　　第三部分 CDK11表達(dá)水平下調(diào)增強(qiáng)多柔比星的細(xì)胞毒性作用
　　背景及目的
　　多柔比星是一種抗腫瘤抗生素，對(duì)多種腫瘤均有作用，其作用機(jī)理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成，多柔比星單獨(dú)或聯(lián)合異環(huán)磷酰胺是治療高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性脂肪肉瘤的一線用藥。CDKs抑制劑

21、作為抗癌藥物的潛力已受到廣泛關(guān)注，目前已有幾種CDKs抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)，CDKs抑制劑和化療藥物聯(lián)合用藥的效果已有很多學(xué)者進(jìn)行探討。CDKs的廣譜抑制劑flavopiridol和多柔比星或其它化療藥物聯(lián)合用藥在治療多種癌癥的臨床實(shí)驗(yàn)中均得到較好的臨床效果。CDK11抑制劑具有作為一種新的抗癌藥物的潛力，但目前尚無CDK11的特異性抑制劑，故選擇CDK11 siRNA與多柔比星兩者聯(lián)合作為研究對(duì)象，本部分探討CDK11 siRNA與多柔

22、比星兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究脂肪肉瘤細(xì)胞中CDK11蛋白表達(dá)水平下調(diào)對(duì)化療藥物多柔比星細(xì)胞毒性作用的影響。
　　研究方法
　　為確定脂肪肉瘤細(xì)胞中CDK11蛋白表達(dá)水平的下調(diào)對(duì)化療藥物細(xì)胞毒性作用的影響，脂肪肉瘤細(xì)胞SW872和SW982轉(zhuǎn)染CDK11 siRNA后加入化療藥物多柔比星，MTT法分析CDK11 siRNA與多柔比星兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果
　　SW872和SW982

23、分別選擇濃度為5nM和10nM的CDK11 siRNA，這個(gè)濃度下的siRNA對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞的生長抑制率約為30％。Western blotting結(jié)果證實(shí)此濃度下的siRNA明顯下調(diào)CDK11的表達(dá)水平。與單一治療相比，CDK11siRNA和多柔比星的聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長和增殖?？梢奀DK11基因下調(diào)增強(qiáng)了多柔比星對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞的毒性作用。
　　結(jié)論
　　為評(píng)估脂肪肉瘤細(xì)胞中CDK11基因下調(diào)對(duì)化療藥物細(xì)胞

24、毒性作用的影響，脂肪肉瘤細(xì)胞SW872和SW982轉(zhuǎn)染CDK11 siRNA后加入化療藥物多柔比星，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK11基因下調(diào)能增強(qiáng)化療藥物多柔比星的細(xì)胞毒性作用，這提示CDK11抑制劑能夠增強(qiáng)腫瘤化療藥物的療效，故其可用于化療藥物的輔助或聯(lián)合用藥，CDK11抑制劑和化療藥物聯(lián)合用藥有可能成為一種治療癌癥的新策略。
　　全文結(jié)論
　　1.CDK11高表達(dá)與惡性脂肪肉瘤的發(fā)生發(fā)展以及生長增殖密切相關(guān)，CDK11基因下調(diào)可明顯抑

25、制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長和增殖，CDK11在惡性脂肪肉瘤的生長增殖過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。
　　2.CDK11基因下調(diào)能夠通過下調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和Survivin表達(dá)水平，從而抑制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長和增殖;換言之，CDK11基因通過促進(jìn)抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來抑制凋亡，從而參與了脂肪肉瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展以及生長增殖過程。
　　3.CDK11基因下調(diào)能增強(qiáng)化療藥物多柔比星的細(xì)胞毒性作用，這提示CDK11抑制劑能夠增強(qiáng)