c-Myb調(diào)控Erbin的細(xì)胞周期依賴性表達(dá).pdf

1、目的:Erbin是近年通過酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)的一種新蛋白,屬LAP(LRR and PDZ domains)蛋白家族成員,其結(jié)構(gòu)特征為N端含16個LRR結(jié)構(gòu)域,C端含單一PDZ結(jié)構(gòu)域。Erbin最初被認(rèn)作為ErbB2相互作用蛋白,但近年來的研究發(fā)現(xiàn),Erbin不僅作為細(xì)胞骨架蛋白在細(xì)胞極性形成、維持上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及ErbB2在細(xì)胞中的定位中發(fā)揮重要的作用,而且作為一種接頭蛋白或信號分子,參與細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)控。然而,Erbin

2、的生物學(xué)功能目前仍未完全闡明。
　　 方法:應(yīng)用免疫熒光染色、共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞分裂周期不同時相Erbin的表達(dá)特征。通過Western blot和實(shí)時定量PCR,分析細(xì)胞分裂周期不同時相Erbin mRNA及蛋白水平的表達(dá)。通過雙熒光素酶報道基因分析觀察細(xì)胞分裂周期不同時相E rbin啟動子活性的變化。通過生物信息學(xué)分析Erbin啟動子區(qū)的潛在順式作用元件c-Myb。應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和寡核苷酸沉降實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證c-Myb與

3、Erbin基因啟動子區(qū)近端c-Myb反應(yīng)元件的結(jié)合。對c-Myb反應(yīng)元件進(jìn)行定點(diǎn)突變、應(yīng)用特異性shRNA抑制c-Myb表達(dá)及通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)c-Myb,觀察Erbin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 Erbin的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性
　　 應(yīng)用抗Erbin特異性抗體對人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光,發(fā)現(xiàn)在間期細(xì)胞中Erbin主要定位于細(xì)胞膜附近,而在處于分裂期的細(xì)胞中Erbi

4、n的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。為驗(yàn)證細(xì)胞周期不同時相ErbinmRNA及蛋白水平的變化,我們首先將人乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞用Nocodazole處理16 h,使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,于釋放后不同時間點(diǎn),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的特征;并于各時間點(diǎn)收集細(xì)胞,制備全細(xì)胞裂解液及提取細(xì)胞總RNA,通過Western blot及RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在G0/G1期Erbin的表達(dá)水平最低,S期開始升高,在G2/M期達(dá)高峰。
　　 2在G

5、2/M期Erbin的啟動子活性明顯增高
　　 為證實(shí)在細(xì)胞周期不同時相Erbin轉(zhuǎn)錄水平的變化受Erbin啟動子活性的影響,我們構(gòu)建了含系列Erbin啟動子5’端截短突變體的報告基因載體,與pRL-TK共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,再通過Thymidine雙阻斷和Nocodazole處理,將轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期分別阻滯于G1/S交界期和G2/M期。應(yīng)用雙熒光素酶活性分析,觀察到Erbin啟動子活性在G2/M期明顯增高。
　　 3 c-My

6、b及Erbin啟動子區(qū)的c-Myb反應(yīng)元件調(diào)控Erbin基因轉(zhuǎn)錄
　　 序列分析發(fā)現(xiàn),Erbin啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-86/-103含有1個潛在的c-Myb結(jié)合位點(diǎn)。對該序列進(jìn)行定點(diǎn)突變后,發(fā)現(xiàn)Erbin啟動子活性明顯降低。染色質(zhì)免疫沉淀及寡核苷酸沉降實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),c-Myb能與c-Myb反應(yīng)元件特異性地結(jié)合。通過基因轉(zhuǎn)染,在Hela細(xì)胞中過表達(dá)c-Myb,發(fā)現(xiàn)Erbin啟動子活性明顯升高;而應(yīng)用c-Myb shRNA敲低c