不同劑量的Capsazepine對(duì)LPS致大鼠發(fā)熱的影響.pdf

1、瞬時(shí)感受器電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid subfamilymember1,TRPV1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的一類與多種感受功能有關(guān)的非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白,該蛋白在脊髓和腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá),包括海馬、杏仁核中央、紋狀體、下丘腦、丘腦、黑質(zhì)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、藍(lán)斑、小腦和下橄欖核等。TRPV1可被辣椒素,質(zhì)子(pH值＜6.0),和熱(＞43℃)等多種

2、理化因素激活,激活后誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流,通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度,調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理功能或病理機(jī)制。有研究表明,在體溫調(diào)節(jié)中樞下丘腦視前區(qū)發(fā)現(xiàn)有TRPV1的表達(dá),我們推測(cè)TRPV1可能與下丘腦的體溫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。
　　 LPS是最常見的外源性致熱原,能刺激人體產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原從而提高體溫。Capsazepine是辣椒素受體競(jìng)爭(zhēng)拮抗劑,已廣泛應(yīng)用于TRPV1通道的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用LPS復(fù)制大鼠發(fā)熱模型,在腦室內(nèi)給

3、予不同劑量的TRPV1通道阻斷劑Capsazepine,觀察發(fā)熱時(shí)相的變化、下丘腦組織中TRPV1表達(dá)量,以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,以期探討TRPV1通道在機(jī)體發(fā)熱過(guò)程中的作用,并確定Capsazepine在發(fā)熱大鼠下丘腦內(nèi)抑制TRPV1,進(jìn)而影響機(jī)體體溫的適宜濃度,為進(jìn)一步的深入研究打下基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理。
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼育；
　　 選用健康雄性SD大鼠,體重

4、250～280g,基礎(chǔ)體溫(38.1±0.2)℃,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼育室室溫(20±2)℃,相對(duì)濕度40％～60％,晝夜光照節(jié)律12h:12h,單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食水。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組及處理；
　　 將36只雄性大鼠隨機(jī)分成4組:(1)正常對(duì)照組(Control):6只,側(cè)腦室注射溶劑10μl(溶劑為10％無(wú)水乙醇+10％Tween80+80％生理鹽水),30min后腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(

5、2)Capsazepine組(CPZ):側(cè)腦室注射CPZ10μl,劑量為0.02ml·kg-1。(3)LPS發(fā)熱組(LPS):6只,向側(cè)腦室注射溶劑10μl,30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。(20μg·ml-1,用生理鹽水配制)(Sigma,USA);(4)Capsazepine+LPS組(CPZ+LPS):共18只,根據(jù)CPZ劑量分為3組,即0.01mg·kg-1、0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1組,每組6只

6、。分別向大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射CPZ,且均調(diào)至為10μl。30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。
　　 3、腦室插管；
　　 用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,將頭部固定于立體定位儀,暴露前囟。參照大鼠腦圖譜,用探針在顱骨表面冠狀縫下0.8mm,矢狀縫旁開1.5mm處鉆孔,將外徑為1mm的引導(dǎo)管垂直插入一側(cè)側(cè)腦室內(nèi),深度4.0mm,用牙科水泥固定導(dǎo)管。
　　 4、腹腔內(nèi)植入檢測(cè)體溫用無(wú)線遙測(cè)發(fā)射

7、子；
　　 大鼠在麻醉狀態(tài)下,行腹正中線行剖腹術(shù),腹腔內(nèi)植入發(fā)射子后縫合,將發(fā)射子固定于腹壁上。
　　 術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng),恢復(fù)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用無(wú)線的BW-200數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進(jìn)行體溫測(cè)量。各組在持續(xù)檢測(cè)體溫7小時(shí)后,恢復(fù)5天,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),并在處理后4h處死大鼠,取出下丘腦待測(cè)。
　　 二、下丘腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)測(cè)定。
　　 分離出下丘腦組織,制備成單細(xì)胞懸液,保持細(xì)胞存活率95％以上

8、。Fura-2/AM避光孵育負(fù)載,采用日立F-4500型熒光雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定熒光值,激發(fā)波長(zhǎng)340nm,發(fā)射波長(zhǎng)510nm。
　　 三、Western blot檢測(cè)下丘腦組織TRPV1表達(dá)。
　　 取大鼠下丘腦組織冰浴勻漿,4℃離心(13000 g·min-1,30 min)兩次,取上清。蛋白定量后,電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加兔抗大鼠TRPV1單克隆抗體(1:500),二抗為羊抗兔IgG,ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,凝膠成像系統(tǒng)

9、分析。對(duì)照為β-actin。目的蛋白與相應(yīng)β-actin的灰度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 四、數(shù)據(jù)分析。
　　 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,各組均數(shù)間差異的比較應(yīng)用t檢驗(yàn),,相關(guān)分析采用相關(guān)性檢驗(yàn)分析完成。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、大鼠的體溫變化；
　　 給予大鼠腹腔注射LPS可引起體溫升高,4h左右大鼠體溫值達(dá)到高峰(1.096±0.114℃),之后體溫開始下降

10、;發(fā)熱期間LPS組在各觀察時(shí)間點(diǎn)與Control組間體溫變化均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 當(dāng)預(yù)先經(jīng)側(cè)腦室注入Capsazepine,30min后腹腔注射LPS(CPZ+LPS),大鼠體溫呈明顯升高,在4h左右體溫達(dá)到高峰。Control組及CPZ組各采樣時(shí)間點(diǎn)比較,體溫變化值均有顯著性升高(P＜0.01);與LPS組相比,0.02mg·kg-1劑量組和0.03mg·kg-1劑量組自2h以后,發(fā)熱過(guò)程中的各時(shí)間點(diǎn)△T值均

11、高于LPS組(P＜0.05),且在4～5.5h期間,體溫持續(xù)保持在高峰水平。0.01mg·kg-1劑量在發(fā)熱起始階段略高于LPS組,但各時(shí)間點(diǎn)△T與LPS組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在CPZ三個(gè)劑量組中隨著CPZ給藥劑量的增加,發(fā)熱幅度呈相應(yīng)增加趨勢(shì),但在0.02mg·kg-1劑量組和0.03mg·kg-1劑量組之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 Control組與CPZ組比較各時(shí)間點(diǎn)△T無(wú)顯著性差異(P＞0.0

12、5)。
　　 二、下丘腦神經(jīng)元[Ca2+]i的變化；
　　 Control組和CPZ組下丘腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度之間沒(méi)有顯著性差異。CPZ+LPS組中,0.01mg·kg-1、0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1劑量組下丘腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度值([Ca2+]i)與LPS組比較顯著降低(P＜0.05),其中0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1組下丘腦細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降尤為明顯。下丘腦[Ca2+]I的變化與體

13、溫的變化成正相關(guān)(r=0.942,P＜0.01)Y=133.94+72.07X。
　　 三、下丘腦組織TRPV1表達(dá)的變化；
　　 LPS組在給予LPS后4h的TRPV1表達(dá)量明顯高于Control組(P＜0.05);預(yù)先給予CPZ后再給予LPS,0.01 mg·kg-1組與LPS組的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異,但0.02 mg·kg-1和0.03 mg·kg-1組的表達(dá)水平明顯低于LPS組(P＜0.05)
　　 結(jié)論