中華絨螯蟹Sox21b基因及Dmrt2基因的克隆及組織表達(dá)分析.pdf

1、由于大部分蝦蟹類的染色體數(shù)目多且呈點(diǎn)狀，應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)方法研究蝦蟹類性別決定非常困難，至今相關(guān)的性別決定機(jī)制尚不清楚。本文根據(jù)人的睪丸決定基因(SRY)和Dmrt基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，結(jié)合RACE技術(shù)獲得Sox21b基因的全長序列和Dmrt2保守區(qū)片段，組織表達(dá)檢測結(jié)果表明Sox21b和Dmn2只在性腺中表達(dá)，暗示它們可能在性腺發(fā)育與性別分化中起著重要作用，這兩個(gè)在性腺中特異表達(dá)基因的克隆為今后從分子水平上研究中華絨螯蟹的性別分化過

2、程提供重要分子標(biāo)記。 1.Sox21b基因克隆與組織表達(dá)分析 參照人SRY基因HMG-box保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)一對簡并引物，以雌、雄中華絨螯蟹基因組DNA為模板進(jìn)行簡并引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果雌、雄個(gè)體均擴(kuò)增出一條約200bp的目的片段，初步說明雌雄中華絨螯蟹基因組中均存在SRY盒區(qū)相關(guān)基因(Sox基因)。測序后，共得到兩種不同序列：序列ES1和序列ES2，其片段長度均為220bp，可編碼73個(gè)氨基酸。 根據(jù)ES1和E

3、S2序列分別設(shè)計(jì)兩對特異引物，并以管家基因beta-actin作陽性對照，研究ES1和ES2基因在中華絨螯蟹精巢、肌肉、心臟、肝臟、鰓、胸神經(jīng)團(tuán)等組織以及不同發(fā)育時(shí)期的卵巢中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ES1在檢測的所有組織中均有表達(dá)，而ES2則只在性腺及排出的成熟卵中有表達(dá)，在其它組織中均無表達(dá)。這一檢測結(jié)果說明ES2可能與性別分化或早期胚胎發(fā)育有關(guān)。 以性腺特異表達(dá)的ES2基因?yàn)榛A(chǔ)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增。將

4、測得的序列拼接后得到長為957bp的序列，其中包括3’非編碼區(qū)108bp(不包括PolyA)和835bp的閱讀框，可編碼278個(gè)氨基酸。經(jīng)序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)樹后將其定名為EsSox2ib。其蛋白序列中包括所有Sox基因的保守序列HMG盒區(qū)，還包括位于HMG盒區(qū)C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)多聚丙氨酸區(qū)。果蠅及意大利蜜蜂的Sox21b基因主要在其胚胎及卵子中有表達(dá)，說明它參與胚胎的發(fā)育過程，本文中沒有檢測EsSox21b基因在中華絨螯蟹胚胎中的表達(dá)情況

5、，但是在其排出的成熟卵中檢測到EsSox21b有較強(qiáng)的表達(dá)，說明它有可能作為內(nèi)源RNA參與中華絨螯蟹早期的胚胎發(fā)育過程。根據(jù)所得的cDNA序列在非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，測序結(jié)果表明EsSox21b基因沒有內(nèi)含子。另外，精巢中的EsSox21b序列與排出的成熟卵中的轉(zhuǎn)錄本相比，有兩個(gè)堿基位點(diǎn)的突變和三個(gè)堿基的缺失，這種現(xiàn)象分別是由RNA編輯中的堿基替換和核苷酸刪除編輯造成的。因此，依據(jù)精巢中Essox21b轉(zhuǎn)錄本所推導(dǎo)出的

6、氨基酸序列與成熟卵子中的序列相比有兩個(gè)氨基酸殘基的差異，說明EsSox21b蛋白在兩種性腺中發(fā)揮作用時(shí)需要不同型的蛋白體。 2.Dmrt2基因保守區(qū)的克隆與組織表達(dá) 參照多個(gè)物種的Dmrt基因DM保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡并引物對雌雄中華絨螯蟹的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果雌雄均擴(kuò)增出一條約為150bp的條帶。測序后，最終得到一條138bp的Dmrt基因片段，可編碼46個(gè)氨基酸序列。經(jīng)NCBI中blast搜索后發(fā)現(xiàn)它與人類的Dmrt

7、2最為接近，氨基酸同源性為91％，所以將此Dmrt序列命名為EsDmrt2。與其它物種的Dmrt2基因保守區(qū)的序列比較發(fā)現(xiàn)，它與羅氏沼蟲F的Dmrt2的氨基酸序列完全相同，與脊椎動(dòng)物的Dmrt2基因相比，有三個(gè)氨基酸的差異，但是鋅指結(jié)構(gòu)所必需的氨基酸位點(diǎn)是完全保守的。這說明Dmrt基因在進(jìn)化上非常保守，在進(jìn)化等級越近的物種間保守性越高。 根據(jù)已測得的Dmrt2基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)一對特異引物，并以beta-actin作陽性對照，檢