免疫蛋白組學對旋毛蟲診斷抗原的篩選與鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、旋毛蟲病(trichinellosis)主要因生食或半生食含有旋毛蟲（Trichinella）幼蟲的豬肉或其它動物肉類而感染，是一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病。由于旋毛蟲病無特異性的癥狀和體征，因此，臨床上對本病不易進行及時、正確的診斷。目前，該病的確診主要依靠肌肉活檢和高特異性的免疫學診斷方法，但前者取決于肌肉樣本的大小及感染程度，對于輕度和早期感染者往往不易檢出，即使感染晚期因取材局限陽性率也只有50％左右，且不易被患者接

2、受。在旋毛蟲感染的過程中，幼蟲的排泄分泌(excretory-secretory，ES)蛋白主要來自于桿狀體分泌顆粒，直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原，可刺激宿主產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，被國際旋毛蟲病委員會(International Conference on Trichinellosis，ICT)推薦用于ELISA或Westernblotting檢測血清中的旋毛蟲抗體，但在旋毛蟲感染早期抗體檢出率較低，且與其

3、他寄生蟲感染者之間存在一定的交叉反應(yīng)。本研究對旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進行雙向電泳(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)、Western blotting和質(zhì)譜分析，并對篩選出的旋毛蟲保護性抗體靶向抗原(antigen targeted by protectiveantibodies，ATPA，GenBank No.gi|404638)基因進行了克隆、表達及免疫學鑒定，并將其用于旋毛蟲實驗感染小

4、鼠和旋毛蟲病人血清特異性抗體的檢測，對尋找旋毛蟲病免疫診斷候選抗原及研制高保護性旋毛蟲病疫苗具有一定的科學意義。
　　材料與方法:
　　1旋毛蟲蟲種、血清與實驗動物
　　本文所用蟲種為河南省南陽豬源旋毛蟲(T1)由本實驗室傳代保種。檢測血清包括鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)、裂頭蚴、弓形蟲與日本血吸蟲感染小鼠血清，以及旋毛蟲病人與其他寄生蟲病人血清。實驗動物為昆明小鼠和雌性

5、BALB/c小鼠。
　　2應(yīng)用免疫蛋白組學篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原
　　通過人工消化法和改良貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲，于體外培養(yǎng)后獲得其ES蛋白。將旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)灌胃法感染BALB/c小鼠(300條/只)，在感染后14～42天隔天進行尾靜脈采血，分離血清，應(yīng)用肌幼蟲ES蛋白分別通過ELISA和Western blotting對感染小鼠血清中的旋毛蟲抗體進行檢測，將感染后最早出現(xiàn)旋毛蟲抗體的血清用于后續(xù)

6、實驗。將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進行2-DE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，通過Western blotting應(yīng)用旋毛蟲感染早期抗體陽性血清對旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進行識別，將陽性反應(yīng)的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定。
　　3旋毛蟲ATPA基因的克隆、表達及鑒定
　　將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中分子量為30～40 kDa、通過質(zhì)譜被成功鑒定的陽性反應(yīng)蛋白點在2-DE凝膠和膠片上的灰度值及其比值分別進行比較，從中選出比值最大的ATPA作為研究對象，應(yīng)用基因工

7、程技術(shù)對旋毛蟲ATPA基因進行分子克隆、表達和純化，將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得其免疫血清，通過Western blotting分析其抗原性和免疫原性，應(yīng)用RT-PCR觀察ATPA基因在旋毛蟲不同發(fā)育期（成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲及成囊期幼蟲）是否轉(zhuǎn)錄;應(yīng)用間接免疫熒光抗體試驗(IFT)對ATPA蛋白在旋毛蟲不同發(fā)育期的表達及其在蟲體組織的定位進行分析。
　　4 rATPA用于旋毛蟲感染小鼠與旋毛蟲病人血清抗

8、體的檢測
　　應(yīng)用rATPA蛋白與肌幼蟲ES蛋白分別建立檢測旋毛蟲抗體IgG的rATPA-ELISA與ES-ELISA方法，分別用于檢測旋毛蟲(T1、T2、T3、T4和T7)感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠、旋毛蟲病人及其他寄生蟲病人血清抗體觀察rATPA-ELISA診斷旋毛蟲病的敏感性與特異性。將30只雌性6周齡BALB/c小鼠隨機分為重度(500條/只)、中度(300條/只)、輕度(100條/只)3個感染組（每組10只），應(yīng)用rA

9、TPA-ELISA與ES-ELISA同時對3組小鼠感染后2～42天的血清抗體進行檢測，觀察rATPA-ELISA對旋毛蟲感染早期及輕度感染的診斷價值。5統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，采用卡方檢驗和重復(fù)資料的方差分析進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，檢驗水平為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1應(yīng)用免疫蛋白組學篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原
　　應(yīng)用ELISA及Western blotting

10、方法在小鼠感染旋毛蟲后18天可檢測出血清抗旋毛蟲抗體。分別將200μg和800μg旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白經(jīng)10％和12％凝膠進行2-DE，可將分子量為40～60 kDa和30～40 kDa的蛋白進行很好的分離，分別檢測到約33個和150個蛋白點，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后應(yīng)用旋毛蟲感染后18天的小鼠血清進行Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)有31個陽性反應(yīng)蛋白點，分別經(jīng)胰酶消化后進行MALDI-TOF/TOF-MS分析，共鑒定出7種旋毛蟲

11、蛋白，分別為:2種絲氨酸蛋白酶[serine proteases，SP1.2（到168805931）和SP1.3(gi|13641204，gi|168805933)]、DNaseⅡ(gi|339241449，gi|316974621)、2種假定的胰蛋白酶(putative trypsin，gi|339241891和gi|339241897)、保護性抗體靶向抗原(ATPA，gi|404638)及保守的假定蛋白(conserved hypo

12、thetical protein，gi|316966524)。對成功鑒定的已知功能的7種旋毛蟲蛋白進行功能分類，7種旋毛蟲蛋白均具有催化和水解活性，且與代謝過程有關(guān)。
　　2 ATPA基因的克隆、表達及鑒定
　　通過生物信息學軟件對ATPA基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其不含跨膜區(qū)，但含有信號肽序列（切割位點位于17～18位氨基酸殘基間），且具有良好的抗原性。通過RT-PCR獲得ATPA基因，并將其連接至表達載體pMAL-c2X，成功構(gòu)

13、建了ATPA基因的重組表達質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA。對重組質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA進行IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在74 kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶（載體蛋白43 kDa+目的蛋白31 kDa)，表明重組蛋白表達成功，可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶與包涵體2種形式表達。應(yīng)用Amylose樹脂預(yù)裝柱對表達的rATPA進行純化，將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得免疫血清，ELISA檢測rATPA免疫血

14、清的效價為1∶106。Western blotting結(jié)果顯示，rATPA可被旋毛蟲感染小鼠血清及rATPA免疫血清識別，rATPA免疫血清均可識別旋毛蟲肌幼蟲可溶性蛋白和ES蛋白的天然ATPA。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ATPA基因在旋毛蟲4個發(fā)育期（成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲和成囊期幼蟲）均有轉(zhuǎn)錄;IFT結(jié)果顯示，ATPA蛋白在以上4個發(fā)育期均有表達，且主要定位于蟲體表皮與桿狀體部位。
　　3 rATPA用于旋毛蟲感染小鼠血清抗

15、體的檢測
　　應(yīng)用rATPA-ELISA檢測T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體陽性率分別為96.67％(29/30)、90.00％(27/30)、93.33％(14/15)、40.91％(9/22)和93.75％(15/16)，應(yīng)用ES-ELISA法檢測T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體，分別為100％(30/30)、100％(30/30)、100％(15/15)、90.91％(20/22)和100％(16

16、/16);統(tǒng)計學分析表明rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測T1、T2、T3和T7感染小鼠血清抗體陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），但在檢測T4感染小鼠血清時，rATPA-ELISA的陽性率低于ES-ELISA(P＜0.05)。
　　應(yīng)用rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測旋毛形線蟲感染小鼠血清的抗體陽性率分別為96.67％(29/30)和100％(30/30)(P＞0.05)，檢測裂頭蚴感染小鼠血清的抗體

17、陽性率分別為16.13％(5/31)和3.22％(1/31)(P＞0.05)，檢測日本血吸蟲感染小鼠血清的抗體陽性率分別為68.75％(11/16)和6.25％(1/16)(P＜0.05)。rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測弓形蟲感染小鼠血清及正常小鼠血清均為陰性。
　　4rATPA-ELISA檢測不同劑量旋毛蟲感染小鼠后不同時間的血清抗體水平
　　在重、中、輕度旋毛蟲感染小鼠，rATPA-ELISA首次檢測到旋毛

18、蟲抗體的時間分別是感染后8、12及14天，ES-ELISA首次檢測到旋毛蟲抗體的時間分別是感染后10、8及10天。在旋毛蟲重度感染組，感染后12天和14天，rATPA-ELISA檢測的抗體陽性率分別為20％和40％，ES-ELISA檢測的抗體陽性率分別為80％和100％(P＜0.05);在旋毛蟲中度感染組，感染后10、12和14天，rATPA-ELISA檢測的抗體陽性率分別為0、20％和30％，ES-ELISA檢測的抗體陽性率分別為70

19、％、100％和100％(P＜0.05);在旋毛蟲輕度感染組，感染后12～24天隔天（感染后12、14、16、18、20、22和24天），rATPA-ELISA檢測的抗體陽性率分別為0、10％、10％、10％、30％、30％和30％，ES-ELISA檢測的抗體陽性率分別為10％、60％、80％、80％、80％、100％和100％(P＜0.05)。在輕、中、重度旋毛蟲感染小鼠，rATPA-ELISA檢測到旋毛蟲抗體100％的時間分別是在感染

20、后30、22及28天，ES-ELISA檢測到旋毛蟲抗體100％的時間分別為感染后22、12及14天。結(jié)果表明，在旋毛蟲重、中及輕度感染組，在感染后16、16及26天，rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測的血清抗體陽性率的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　rATPA-ELISA檢測重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異無統(tǒng)計學意義(F=2.049，P＞0.05)，感染后不同時間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=2

21、19.924，P＜0.05)，感染后檢測時間與感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=3.311，P＜0.05);兩兩比較結(jié)果顯示，感染后10～16天及24～28天血清抗體水平均呈升高趨勢(P＜0.05)。ES-ELISA檢測重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異具有統(tǒng)計學意義(F=5.901，P＜0.05)，感染后不同時間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=478.276，P＜0.05)，感染后檢測時間和感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=5.71

22、0，P＜0.05);兩兩比較結(jié)果顯示感染后8～32天血清抗體水平均呈升高趨勢(P＜0.05)。
　　5 rATPA用于旋毛蟲病人血清抗體的檢測
　　rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測旋毛蟲病人血清抗體陽性率均為100％(22/22)，rATPA-ELISA僅在日本血吸蟲病人血清檢測到1例抗體陽性(5.00％)，而檢測并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人及健康人血清抗體均為陰性。rATP

23、A-ELISA檢測旋毛蟲病人血清抗體的敏感性與特異性分別為100％與99.13％。ES-ELISA檢測日本血吸蟲病人、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人抗體抗體陽性率分別為20.00％(4/20)、5.00％(1/20)、14.29％(1/7)、25.00％(5/20)、25.00％(5/20)和12.50％(1/8)，而檢測健康人血清抗體為陰性。rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測日本血吸蟲病人

24、、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和裂頭蚴病人血清的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），而在檢測棘球蚴病人和豬囊尾蚴病人血清時，rATPA-ELISA優(yōu)于ES-ELISA(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用2-DE與質(zhì)譜分析從旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中鑒定出了7種旋毛蟲蛋白（2種絲氨酸蛋白酶、DNaseⅡ、2種胰蛋白酶、保護性抗體靶向抗原及保守的假定蛋白），均具有催化和水解活性，這7種蛋白對旋毛蟲病可能具有潛在的早期診斷價值。