大鼠腦內β淀粉樣蛋白沉積引起的外周血T細胞應答.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是年齡相關的慢性神經系統(tǒng)退行性疾病，嚴重影響老年人的生活質量。因此，研究AD的發(fā)病機制，探索防治AD的干預靶點，是神經科學的工作重點。AD動物模型是研究工作的重要工具。 在對AD發(fā)病因素的研究過程中，發(fā)現(xiàn)p淀粉樣蛋白(beta—amyloidprotein，Aβ)在腦內的沉積是AD發(fā)病的早期過程和中心環(huán)節(jié)。聚集態(tài)的Aβ發(fā)揮神經毒性，啟動了AD的病理進程，包括膠質的廣泛活

2、化、炎性微環(huán)境產生、神經元功能紊亂及死亡等。 Aβ的沉積活化腦內具有吞噬活性的小膠質細胞，引起先天性免疫應答(innate immune response)。Ap能否募集外周血免疫細胞穿過血腦屏障進入腦向炎癥部位聚集，引起過繼性免疫應答(adaptive immune response)尚不清楚。血腦屏障由微血管內皮細胞、基底膜和星型膠質細胞的足突構成，將腦實質和血液分開，正常情況下免疫系統(tǒng)的細胞和分子不能自由進入腦。但是，隨著

3、研究不斷進展，人們逐漸認識到，即使在生理狀態(tài)下，中樞神經系統(tǒng)內也存在免疫監(jiān)視過程。外周淋巴細胞可以主動進入腦實質，啟動腦內的免疫應答，清除可能會引起腦病變的因子。 。 淋巴細胞穿過血腦屏障是一個復雜的過程。淋巴細胞和微血管內皮細胞表面表達的黏附分子及其受體的相互作用發(fā)揮了重要作用。本研究室陳譽華課題組在研究AD病人T細胞穿過血腦屏障機制的過程中，發(fā)現(xiàn)AD病人外周血T淋巴細胞穿過血腦屏障體外模型——人腦微血管內皮細胞單層的能

4、力顯著增高；并且證實AD病人外周血T淋巴細胞高表達巨嗜細胞炎癥蛋白－1α(macrophage inflammatory protein－1α，MIP－1α)；MIP－1α通過調控內皮細胞骨架而引起內皮細胞間的緊密連接開放。基于此，本研究采用立體定向注射的方法，建立Aβ在腦內沉積的動物模型，旨在研究外周血T細胞所表達的MIP-1a是否為T細胞穿過血腦屏障的決定因子，同時分析人腦的T細胞在AD病變中的可能作用。 1、建立腦內沉積A

5、β的動物模型 制備聚集態(tài)Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>，通過立體定位技術將Aβ<,1-42>注射到Wist-ar大鼠雙側海馬，對照組注射等體積的Aβ<,42-1>和PBS。 2、標本采集與處理 分別于海馬注射后3天、7天和14天，從大鼠心臟采血，肝素抗凝。然后經左心室依次灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，立即取腦。制備冰凍切片時，腦組織經后固定和蔗糖溶液浸泡，冰凍切片機上行冠狀切片，片厚10um，隔lO取l，連

6、續(xù)取10張切片。制備石蠟切片時，腦組織經后固定和常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，石蠟切片機上行冠狀切片，片厚5um，隔10取1，連續(xù)取10張切片。 3、實時定量PCR法檢測外周血T細胞中MIP-1僅和CCR5 mRNA的表達水平 構建用于實時定量PCR分析的標準品質粒pUCmT-MIP-1a、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH：利用單個核細胞分離液和MagCellect RatCD3<'+>T Cell Is

7、olation試劑盒，分離外周血T細胞。通過Trizol試劑提取T細胞總RNA，并反轉錄成cDNA。根據(jù)MIP-1a、CCR5和GAPDH的基因序列，按定量PCR檢測的要求設計引物和Taqman探針。利用PCR技術從T細胞擴增MIP-1a、CCR5和GAPDH基因片段。通過T-A克隆將MIP—la、CCR5和GAPDH基因片段連接到pUCmT載體上，命名為pUCmT-MIP-lA、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH。將重組質粒

8、轉化感受態(tài)細菌DH5a，通過藍白篩選，酶切鑒定，驗證插入片段的存在。將重組質粒送交測序，驗證插入片段序列的正確性。 實時定量PCR檢測MIP-1a和CCR5：采用相對定量法。以GAPDH作為歸一化MIP-1a、CCR5的持家基因。以構建的重組質粒DNA為標準品，以質粒初始模板絕對量的對數(shù)作橫坐標、Ct值作縱坐標制作標準曲線。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每個標本目的基因的mRNA表達水平的相對量。4、觀

9、察Aβ<,1-42>沉積對T細胞穿過血腦屏障的影響 利用Aβ<,1-42>的抗體，通過免疫熒光技術觀察Aβ<,1-42>在腦內的沉積。利 用vWF和CCR5的抗體，通過雙免疫熒光技術觀察Aβ<,1-42>沉積對腦微血管 內皮細胞表達MIP-lα的受體CCR5的影響。利用CD3的抗體，通過免疫 熒光技術觀察Aβ<,1-42>沉積對T細胞穿過血腦屏障的影響。利用CD4和 CD8的抗體，通過免疫熒光技術分析穿過血腦屏障的T細胞

10、的亞型。大鼠 腹腔注射MIP-lα的中和抗體，觀察阻斷MIP-1α的效應對T細胞穿過血 腦屏障的影響。 5、觀察干預T細胞人腦對Aβ<,1-42>沉積所引起的小膠質細胞活化和神經 細胞凋亡的影響。 利用CDl1b的抗體，通過免疫組織化學技術觀察Aβ活化的小膠質細 胞吞噬沉積的Aβ<,1-42>。利用活化caspase一3的抗體，通過免疫熒光技術觀 察海馬內注射Aβ<,1-42>后腦內神經細胞凋亡的情況。通過尼氏

11、染色觀察 Aβ<,1-42>沉積引起的神經元損傷。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，觀察 阻斷MIP-1α的效應對對小膠質細胞增生、活化和神經細胞凋亡的影響。 6、觀察海馬內注射Aβ<,1-42>對神經前體細胞增殖和分化的影響 利用Brdu能摻入細胞周期的S期，標記增殖細胞的特性，將Brdu注射 人大鼠腹腔。利用Brdu的抗體，通過免疫組織化學技術觀察海馬內注射 Aβ<,1-42>對細胞增殖的影響。利用DCX的

12、抗體，通過免疫熒光技術觀察海馬 內注射Aβ<,1-42>對產生未成熟神經元的影響。利用Brdu和DCX的抗體，通過雙免疫熒光技術觀察海馬內注射Aβ<,1-42>后增殖細胞的表型。 1、成功制備了Aβ在腦內沉積的動物模型。 2、腦內Aβ<,1-42>沉積誘導外周血T細胞過表達MIP-lα，促進T細胞穿過血腦屏障入腦 腦內Aβ<,1-42>沉積引起大量外周血T細胞穿過血腦屏障遷移入腦，與對照組比，數(shù)量顯著增加(P<

13、0.01)，主要分布在大腦皮質和海馬，CD4<'+>T細胞和CD8<'+>T細胞都可被觀察到。進一步研究發(fā)現(xiàn)腦內Aβ<,1-42>沉積誘導外周血T細胞過表達MIP-1α，與對照組比，顯著增高(P<0.01)；但不上調其受體CCR5在T細胞中的表達(P>0.05)。Aβ<,1-42>沉積還上調了腦微血管內皮細胞膜上CCR5的表達。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，阻斷MtP-1α的效應后，外周血T細胞進入腦內的數(shù)量明顯減少，與注射同型I

14、gG的對照組比，差異顯著(P<0.01)。 3、阻斷T細胞入腦抑制了腦內Aβ<,1-42>沉積引起的小膠質細胞的活化 Aβ<,1-42>沉積引起CDllb陽性小膠質細胞數(shù)量顯著增加并活化，與對照組比，差異顯著(P<0.01)，表現(xiàn)為由靜止的分枝狀轉變?yōu)榛罨陌⒚装蜖睿恢饕M織相容性復合物(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子陽性小膠質細胞數(shù)量也比對照組顯著增加(P<0.01)。

15、并且MHCⅡ類分子陽性小膠質細胞向沉積的AB。一心遷移并加以吞噬。大鼠海馬內注射Aβ<,1-42>還引起了神經細胞凋亡數(shù)量比對照組顯著增多(P<0.01)。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體阻斷T細胞入腦抑制了小膠質細胞增生和活化，但未能抑制神經細胞凋亡。 4、大鼠海馬內注射Aβ<,1-42>增強了神經前體細胞增殖和分化能力 Aβ<,1-42>沉積引起海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)和側腦室

16、下層(subventricular zone，SVZ)Brdu標記細胞比對照組顯著增多(P<0.01)。同時發(fā)現(xiàn)SGZ和SVZ區(qū)DCX陽性細胞也比對照組顯著增多(P<0.01)。雙免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)Brdu標記的增殖細胞多為新生神經元。 1．大鼠腦內Aβ沉積能特異性地誘導外周血T細胞高表達MIP-1α，并上調腦微血管內皮細胞上CCR5的表達。 2．T細胞表達的MIP-1α與腦微血管內皮細胞表面的CCR5的相互作用可能參與到