養(yǎng)殖刺參（Apostichopus japonicus）“腐皮綜合癥”重要病原的核酸檢測技術(shù).pdf

1、對本實(shí)驗(yàn)室鑒定的成參“腐皮綜合癥”主要致病菌--燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的16s-23s間區(qū)(Intergenic spacer,IGS)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆、測序和分析，設(shè)計(jì)出針對燦爛弧菌的特異性PCR引物，建立了PCR檢測方法。從純化的Vibrio splendidus DNA和攜帶Vibrio splendidus刺參組織DNA中成功地?cái)U(kuò)增出產(chǎn)物大小為177 bp的DNA片段，該對引物對Vibrio spl

2、endidus的檢測靈敏度為0.5pg，與其它細(xì)菌Vibrio fluvialis、Vibrio angillar-um、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的DNA均無交叉反應(yīng)。 在已建立的Vibrio splendidus PCR檢測方法的基礎(chǔ)上利用非放射性標(biāo)記物地高

3、辛(D-IG)制備了DNA探針，通過核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測方法對此探針特異性及靈敏度進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明其對Vibrio splendidus DNA的檢出靈敏度為6.25 pg，且無非特異性的反應(yīng)，說明該探針具有較高的靈敏度及特異性。對人工感染和取自青島、煙臺、威海呈現(xiàn)皮膚潰爛等典型“腐皮綜合癥”的海參提取潰爛組織DNA，然后用PCR和斑點(diǎn)雜交對上述樣品進(jìn)行檢測，陽性檢出率均為100％。 同時用上述制備的探針進(jìn)行原位雜交檢測，結(jié)果

4、證明在體壁結(jié)締組織、肌肉組織、腸粘膜上皮和輻水管檢測到陽性雜交信號。 在建立PCR、斑點(diǎn)雜交及核酸探針原位雜交檢測技術(shù)等快速檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，對人工感染試驗(yàn)患病刺參潰爛組織、未患病刺參組織以及空白對照組等樣品不經(jīng)過細(xì)提組織DNA，通過組織勻漿直接進(jìn)行快速檢測。結(jié)果顯示：采取粗提DNA的方式進(jìn)行PCR和斑點(diǎn)雜交快速檢測，陽性檢出率比細(xì)提組織DNA的檢出率低，用原位雜交對未出現(xiàn)病癥的刺參的陽性檢出率低于出現(xiàn)病癥海參的陽性檢出率。PC