脆性X綜合癥神經(jīng)元發(fā)育與突觸可塑性異常機制研究.pdf

1、【目的】
　　脆性X綜合癥(Fragile X syndrome,FXS)是臨床最常見的遺傳性智力低下癥,探索其發(fā)病機制及治療途徑是社會和臨床都急需解決的一個重要課題。脆性X綜合癥是由Fmr1基因的突變而導(dǎo)致體內(nèi)缺乏其所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物FMRP引起。FMRP是一種與核糖體相關(guān)的mRN A結(jié)合蛋白,參與mRN A的聚集并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄效率,主要抑制蛋白表達,從而影響神經(jīng)元的發(fā)育成熟和突觸可塑性。目前廣泛接受的觀點認為,脆性X綜合癥

2、中FMRP表達缺失,引起代謝型谷氨酸受體(mGluR)依賴性翻譯過表達,導(dǎo)致神經(jīng)元成熟早期形態(tài)異常和突觸傳遞紊亂,最終表現(xiàn)出發(fā)育遲滯、癲癇發(fā)作和智力障礙等典型臨床癥狀。可見,FMRP調(diào)控蛋白翻譯異常是脆性X綜合癥發(fā)病的關(guān)鍵。
　　脆性X綜合癥的突觸可塑性異常,主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上樹突發(fā)育障礙和功能上突觸傳遞紊亂。對Fmr1基因敲除(knock-out,KO)小鼠的形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn),突觸部位谷氨酸AMPA受體密度降低,棘突變得細長;腦片電

3、生理記錄發(fā)現(xiàn),前扣帶回(anterior cingulated cortex,ACC)皮層錐體神經(jīng)元長時程增強(long-term plasticity,LTP)明顯減弱;行為學發(fā)現(xiàn),額葉皮層參與的恐懼記憶能力降低。
　　星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞的主要組成部分。近年來研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細胞除了對神經(jīng)元有營養(yǎng)和保護作用,還具有一些免疫學特性,所以對神經(jīng)性疾病的防治有重要的研究價值。星型膠質(zhì)細胞可表達多種神經(jīng)遞質(zhì)受體,并能釋放

4、許多已知或者未知的神經(jīng)活性成分,從而促進發(fā)育中神經(jīng)元的存活、分化及正確遷移。研究表明,脆性X綜合癥患者體內(nèi)神經(jīng)元樹突長度降低并伴隨分支增多。當神經(jīng)元與Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)時,樹突生長發(fā)育障礙;而與野生型(wild-type,WT)星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)時,神經(jīng)元形態(tài)明顯得到改善。這提示星形膠質(zhì)細胞參與了脆性X綜合癥中神經(jīng)元的發(fā)育障礙,但其作用機制仍不清楚。
　　調(diào)節(jié)突觸可塑性的因素有多種,雌激素作為類固醇激素的代表,在生殖

5、系統(tǒng)、骨骼和心血管中發(fā)揮重要作用,近年來其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用成為關(guān)注的焦點。17β-雌二醇能易化 LTP的誘導(dǎo),促進樹突棘形成和突觸發(fā)生,提高認知能力。但是,雌激素在FXS的作用尚不清楚。由于FXS中FMRP缺失導(dǎo)致臨床最重要的特征是智力低下,因此我們研究 FMRP在學習記憶中的作用,以及雌激素調(diào)節(jié)異常突觸可塑性的信號通路。
　　本研究擬分別從星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)可塑性,以及雌激素調(diào)節(jié)突觸功能可塑性的角度,闡明脆性X綜合癥中突

6、觸可塑性異常的機制,為發(fā)掘潛在的藥物治療靶點和臨床治療策略提供新的思路和理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.先將野生型(wild-type,WT)和Fmr1基因敲除(knock-out,KO)星型膠質(zhì)細胞分別與神經(jīng)元共培養(yǎng),觀察星型膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元樹突發(fā)育的影響;再分別收集WT與KO星型膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)液(astrocyticconditioned medium,ACM)用以培養(yǎng)神經(jīng)元,從形態(tài)學比較7天后神經(jīng)元樹突發(fā)育的差異

7、。
　　2.采用分子克隆手段構(gòu)建FMRP蛋白的表達載體,對Fmr1 KO星型膠質(zhì)細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染后,再收集其ACM用以培養(yǎng)神經(jīng)元,觀察星型膠質(zhì)細胞中FMRP蛋白對神經(jīng)元樹突發(fā)育的作用。
　　3.利用HPLC法檢測WT和KO ACM中神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的濃度,通過活性氧和丙二醛兩個指標評價過量谷氨酸對氧化應(yīng)激的影響。
　　4.利用ELISA法分別檢測體外ACM和體內(nèi)腦勻漿液中神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF,BDNF,NT-3,GDNF和

8、CNTF的濃度。在WT ACM中外源性給予過量神經(jīng)營養(yǎng)因子,在KO ACM中用抗體中和過量神經(jīng)營養(yǎng)因子,觀察神經(jīng)元形態(tài)和突觸蛋白表達的變化,進一步證實異常含量的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以影響神經(jīng)元樹突發(fā)育。
　　5.根據(jù)FMRP為RNA結(jié)合蛋白的特性,采用RNA結(jié)合蛋白共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)技術(shù),觀察FMRP是否結(jié)合某些RNA,抑制其在正常水平中的過量表達。
　

9、　6.通過shRNA降低Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞中過量表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子,觀察其ACM對神經(jīng)元生長狀態(tài)的改善作用,再將干擾后的細胞定位注射到Fmr1 KO小鼠的前扣帶回區(qū),建立條件性恐懼記憶模型,觀察其學習記憶能力的變化。
　　7.采用免疫印跡技術(shù),觀察E2或者協(xié)同使用mGluR5拮抗劑DL-AP3,對WT和KO神經(jīng)元中AMPA受體GluR1亞基膜表達和磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。
　　8.應(yīng)用膜片鉗和Med64電生理技術(shù),觀察

10、E2或者協(xié)同使用mGluR5拮抗劑DL-AP3,對WT和KO腦片ACC區(qū)中LTP的誘導(dǎo)作用。
　　9.采用免疫共沉淀技術(shù),觀察E2對WT和KO神經(jīng)元中ERα-CAV1-mGluR1/5復(fù)合物形成的作用。
　　10.通過shRNA降低Fmr1 KO神經(jīng)元中CAV1表達,觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)元GluR1的胞膜分布,體內(nèi)腦片LTP的誘導(dǎo)、樹突棘形態(tài)的變化和動物行為的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.不論是WT還是KO神經(jīng)元,只

11、要與Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng),都會發(fā)生形態(tài)異常。神經(jīng)元在KO ACM中出現(xiàn)生長障礙,對Fmr1KO星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染FMRP真核表達載體后,其ACM可顯著改善神經(jīng)元樹突的生長。
　　2.Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞通過合成和轉(zhuǎn)運機制,釋放過量神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸,引起神經(jīng)元過度氧化應(yīng)激。
　　3.Fmr1 KO小鼠大腦皮層和ACM中NT-3的含量均顯著高于正常組,而其余四種星形膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子沒有明顯差異。這是由于F

12、MRP結(jié)合NT-3基因,導(dǎo)致Fmr1 KO星型膠質(zhì)細胞中的NT-3基因水平?jīng)]有改變,但蛋白水平升高。
　　4.當在WT ACM中外源性給予過量NT-3時,樹突發(fā)育異常程度隨NT-3濃度的升高而增加。相反地,在KO ACM中用抗體中和NT-3時,神經(jīng)元發(fā)育狀態(tài)與中和抗體的使用劑量呈非線性相關(guān)。只有合適的濃度才可以恢復(fù)神經(jīng)元形態(tài),而過高和過低濃度的抗體均不能有效恢復(fù)神經(jīng)元形態(tài)異常。
　　5.慢病毒介導(dǎo)小干擾RNA從基因水平抑制N

13、T-3在Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞中的過量表達后,通過收集其AC M可顯著改善神經(jīng)元生長狀態(tài),將干擾后的細胞定位注射到幼年Fmr1 KO小鼠的前扣帶回區(qū),其腦內(nèi)NT-3水平降低,缺失的恐懼記憶能力顯著恢復(fù)。
　　6.E2通過作用于膜上受體介導(dǎo)的非基因組效應(yīng),可快速調(diào)節(jié)AMPA受體GluR1亞基向膜轉(zhuǎn)移,以及增強GluR1磷酸化水平。但在Fmr1 KO神經(jīng)元中E2介導(dǎo)的上述效應(yīng)消失;并且,在Fmr1 KO小鼠的ACC腦片中E2易化L

14、TP誘導(dǎo)作用也消失。
　　7.協(xié)同使用E2和mGluR1/5拮抗劑DL-AP3可以在Fmr1 KO小鼠腦片上誘導(dǎo)出明顯的LTP,并且可以促進Fmr1 KO神經(jīng)元中GluR1向膜轉(zhuǎn)移和Ser831位點的磷酸化。
　　8.Fmr1 KO小鼠中雌二醇濃度、ERs表達與定位均正常,但是雌激素受體ERα偶聯(lián)過度激活的I型mGluR,致使Gq蛋白-PLC-PKC信號異常。
　　9.微囊蛋白CAV1通過形成細胞內(nèi)凹陷使ERα與mGl

15、uR1/5偶聯(lián),E2促進WT神經(jīng)元中ERα和CAV1的結(jié)合;而在Fmr1 KO神經(jīng)元中,由于缺失FMRP蛋白結(jié)合CAV1基因,導(dǎo)致CAV1過表達并與ERα過度結(jié)合,對E2的信號傳遞無響應(yīng)。
　　10.體外干擾Fmr1KO神經(jīng)元中CAV1的表達后,E2可促進GluR1 Ser831位點磷酸化,GluR1向胞膜分布以及ERα-CAV1-mGluR1/5復(fù)合物的形成。Fmr1 KO小鼠ACC區(qū)注射CAV1shRNA后,E2可以誘導(dǎo)出LT

16、P,并增加錐體神經(jīng)元中蘑菇狀樹突棘比例,不論是成年雄性還是卵巢切除后的雌性小鼠,E2均可提高其恐懼記憶能力。
　　【結(jié)論】
　　1.證實星形膠質(zhì)細胞在脆性X綜合癥中的重要作用,Fmr1 KO星形膠質(zhì)細胞釋放過量神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3,引起神經(jīng)元樹突生長發(fā)育障礙。
　　2.闡明 FMRP缺失導(dǎo)致 NT-3分泌過多的分子機制,干擾星形膠質(zhì)細胞來源NT-3,可顯著改善脆性X綜合癥中神經(jīng)元樹突形態(tài)和動物發(fā)育早期的