缺氧對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生物學(xué)特征的影響.pdf

1、目的：
　　 通過使用氟波脂（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、重組人白細(xì)胞介素4( Recombinant Human Interleukin-4，IL-4)刺激人單核白血病THP-1細(xì)胞株，獲得M2型巨噬細(xì)胞。然后分別在缺氧和常氧條件下，對(duì)M2型巨噬細(xì)胞和人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。觀察缺氧對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞自噬及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1．

2、用PMA刺激誘導(dǎo)人單核白血病THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，再通過IL-4刺激巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞。2．構(gòu)建transwell非接觸共培養(yǎng)體系，分別在常氧和缺氧條件下對(duì)M2型巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及與HCT-116細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)24h、48h。3．實(shí)驗(yàn)分組：將M2型巨噬細(xì)胞常氧條件單獨(dú)培養(yǎng)24h、48h兩組作為對(duì)照組，再設(shè)缺氧單獨(dú)培養(yǎng)24h、48h，常氧共培養(yǎng)24h、48h及缺氧共培養(yǎng)24h、48h共計(jì)六個(gè)實(shí)驗(yàn)組。4．分別收集不同培養(yǎng)條

3、件和不同培養(yǎng)時(shí)間的M2型巨噬細(xì)胞，提取蛋白，western-blot檢測(cè)各組標(biāo)本中的自噬特異性蛋白beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3,LC-3）的表達(dá)。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)上清液中的白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素（Interleukin-12，IL-12）、腫瘤壞死因子α(Tu

4、mor necrotic factor-α，TNF-α)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD68分子表達(dá)率為86.35％。2．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoabsorbentassay，ELISA)檢測(cè)IL-1β實(shí)驗(yàn)各組中常氧共培養(yǎng)組(24h、48h)、缺氧單獨(dú)培養(yǎng)組(24h、48h)與對(duì)照組(24h、48h)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P＞0.05)，缺氧共培養(yǎng)組24h:0.7900±2.65%,48h：0.7433±4.16%分別與對(duì)照組24h:0.8717±5.11%,48h：0.8733±3.21%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，缺氧共培養(yǎng)組24h、48h IL-1β表達(dá)均下調(diào)。實(shí)驗(yàn)組各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IL-12和TNF-α的實(shí)驗(yàn)各組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-12和TNF-α表達(dá)在缺氧及共培養(yǎng)作用下無明顯變化。

6、　　 通過測(cè)量LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的灰度值比值，常氧各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。缺氧各組LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值：缺氧單獨(dú)培養(yǎng)24h、48h，缺氧共培養(yǎng)24h、48h分別為0.3714±5.49%、1.0706±8.00%、0.4203±5.07%、1.1377±6.18與對(duì)照組24h、48h的比值0.2590±0.78%、0.2617±0.82%比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)并與缺氧時(shí)間正相關(guān)。Beclin1蛋白

7、表達(dá)在常氧各組內(nèi)參灰度值比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺氧各組Beclin1表達(dá)相對(duì)值即Beclin1/β-actin的灰度值比值：缺氧單獨(dú)培養(yǎng)24h、48h，缺氧共培養(yǎng)24h、48h分別為0.4385±2.04%、0.6451±3.96%、0.6871±2.21%、8235±7.70%與對(duì)照組24h、48h的灰度值比值0.2876±0.67%、0.2856±1.420比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，差異與缺氧時(shí)間正