靶向VEGF和VEGFR2的shRNA在抗腫瘤研究中的應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、血管新生是腫瘤生長、發(fā)展的必經(jīng)之路,與實體瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系,許多腫瘤僅在新血管生成后才出現(xiàn)臨床癥狀。因此,針對腫瘤進行抗新生血管治療具有重要的學術(shù)意義和臨床應用價值。VEGF是主要的新生血管刺激因子,它與細胞表面的受體結(jié)合,通過旁分泌和自分泌的方式來促進血管的生成。1998年發(fā)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)已成為繼反義核酸后發(fā)展起來的一項高效特異抑制基因表達的新技術(shù)。本研究選擇采用RNA干擾技術(shù)探討靶向VEGF及其受體VEGFR2的sh

2、RNA載體的構(gòu)建及其抗腫瘤活性,并討論VEGF在腫瘤發(fā)展中的重要作用。 一、靶向VEGF的穩(wěn)定干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究由于shRNA非病毒表達載體轉(zhuǎn)染效率相對較低,而且瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA可能在細胞內(nèi)促發(fā)干擾素效應,引起非特異性毒性,造成非靶基因特異的功能改變,因此我們設計構(gòu)建了應用于基因功能研究的shRNA非病毒表達載體pCD-shRNA,盡量避免上述問題的出現(xiàn)。載體采用pcDNA3.0的基本質(zhì)粒序列,刪除其原有的CMV

3、啟動子避免干擾,連入了RNA聚合酶Ⅲ可識別的、用于起始shRNA轉(zhuǎn)錄的H1啟動子,該載體插入表達shRNA的DNA序列后可在哺乳動物細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄出shRNA,實現(xiàn)靶基因的長效抑制。 根據(jù)siRNA的設計原理,我們選擇VEGFmRNA上四個不同靶位作為siRNA切割位點,合成四對DNA引物,連入載體。瞬時轉(zhuǎn)染細胞后,ELISA分析發(fā)現(xiàn)四個質(zhì)粒都可以降低細胞內(nèi)VEGF的表達,但降低程度不一。選擇抑制效果最佳的質(zhì)粒pCD-V382,

4、進行后續(xù)的研究工作。 將pCD-V382轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤HT1080細胞,經(jīng)G418篩選得到單克隆,擴大培養(yǎng)后,采用ELISA和WesternBlotting對細胞培養(yǎng)上清和細胞總蛋白中的VEGF量進行檢測,選擇表達量最低的HT1080-V3細胞株進行深入研究。 獲得穩(wěn)定系細胞后,首先考察其在增殖方面的變化。結(jié)果顯示HT1080-V3細胞與對照組細胞相比,生長速度和克隆形成率都未改變,說明腫瘤細胞在體外的增殖能力不受VEG

5、F表達的影響。 MatrigelInvasionAssay檢測細胞20小時內(nèi)對基底膜的侵襲能力,結(jié)果顯示HT1080-V3組細胞與對照組HT1080細胞相比,穿過基底膜的數(shù)量明顯減少,HT1080-V3組和HT1080-M組(轉(zhuǎn)錄無義shRNA的HT1080細胞)穿過基底膜的細胞數(shù)分別是HT1080組的26.8%和92.7%,說明VEGF持續(xù)低表達可降低細胞對基底膜的侵襲能力。 劃痕實驗檢測細胞的運動能力,結(jié)果顯示12小

6、時后,HT1080-V3組的劃痕依然清晰可見,說明VEGF持續(xù)低表達可減弱細胞的運動能力。 對細胞的粘附能力進行了檢測,結(jié)果表明HT1080-V3組同種細胞之間的粘附能力強于HT1080和HT1080-M組,但其對臍靜脈內(nèi)皮細胞的異種粘附能力卻未出現(xiàn)變化。 對裸鼠進行異種移植觀察細胞的成瘤性。結(jié)果顯示接種HT1080和HT1080-M細胞組的裸鼠分別在第9天和第15天出現(xiàn)可觸摸的腫瘤,此后腫瘤生長速度迅速,而接種HT10

7、80-V3細胞組的裸鼠至第54天仍未出現(xiàn)明顯移植瘤,免疫組化結(jié)果顯示HT1080組和HT1080-M組移植瘤中VEGF表達水平高于HT1080-V3組。說明VEGF持續(xù)低表達可顯著降低細胞的成瘤性。 上述結(jié)果表明:1.我們構(gòu)建的質(zhì)粒pCD-shRNA在哺乳動物細胞內(nèi)能實現(xiàn)持續(xù)轉(zhuǎn)錄shRNA的目的;2.靶向抑制腫瘤細胞分泌的VEGF能有效防止腫瘤的發(fā)生。 二、靶向VEGF和VEGFR2的RNA干擾質(zhì)粒在前列腺癌中的治療VE

8、GF和VEGFR結(jié)合后,通過受體二聚化,誘導受體胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基自動磷酸化和細胞內(nèi)信號蛋白的酪氨酸磷酸化,傳導胞內(nèi)信號,發(fā)揮生物學效應。近年的研究發(fā)現(xiàn),除腫瘤血管內(nèi)皮細胞表達VEGF受體外,許多腫瘤細胞自身也有VEGF受體表達,針對VEGF及其受體的干預措施可以阻止腫瘤的生長。 我們選擇VEGF和VEGFR2都高表達的前列腺癌DU145細胞,構(gòu)建了分別針對VEGF和VEGFR2的干擾質(zhì)粒pCSH1-V382和pCSH1-R21

9、,檢測它們各自的抗腫瘤活性。同時,我們還構(gòu)建了可以同時轉(zhuǎn)錄出VEGFshRNA和VEGFR2shRNA的質(zhì)粒pCSH1-VR2,觀察同時以該通路上的兩個蛋白為靶點,其抗腫瘤作用是否有所增強。 結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCSH1-V382或pCSH1-R21后,DU145細胞的VEGF或VEGFR2在mRNA水平和蛋白水平上都出現(xiàn)了明顯降低,轉(zhuǎn)染pCSH1-VR2后細胞的VEGF和VEGFR2的mRNA和蛋白水平都出現(xiàn)了明顯降低。侵襲

10、實驗表明轉(zhuǎn)染pCSH1-V382和pCSH1-R21組細胞對基底膜的侵襲能力都出現(xiàn)減弱,抑制率分別為對照組的56.1%和52.3%,轉(zhuǎn)染pCSH1-VR2組細胞的侵襲能力低于上述兩組,其抑制率為66.4%。 我們采用人前列腺癌DU145裸鼠體內(nèi)移植模型檢測三種質(zhì)粒的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果顯示,0.75mg/kg瘤內(nèi)給藥,隔天一次,自接種后第7天起共給藥10次,第56天時pCSH1-V382和pCSH1-R21對腫瘤生長的抑制率分別

11、為60%和57.7%,兩者抑瘤效果接近。而pCSH1-VR2抑瘤率為54.8%,未見增強。對腫瘤組織的冰凍切片進行免疫組化分析,結(jié)果顯示pCSH1-V382、pCSH1-R21與pCSH1-VR2給藥組的腫瘤組織中VEGF水平低于對照組和pCSH1-MOCK處理組。 將上述質(zhì)粒與紫杉醇聯(lián)合用藥,紫杉醇的給藥劑量是10mg/kg,在第7天和第14天各腹腔注射給藥一次,各質(zhì)粒用量為0.75mg/kg瘤內(nèi)給藥,隔天一次,自接種后第7天

12、起聯(lián)合給藥9次。結(jié)果顯示,pCSH1-V382與紫杉醇聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。第56天時,pCSH1-V382單獨給藥組、紫杉醇單獨給藥組及兩者聯(lián)合用藥組的抑瘤率分別為61%、56%和89%,CDI值為0.82,而pCSH1-R21及pCSH1-VR2分別與紫杉醇聯(lián)合使用后,雖然抑瘤率效果均強于單獨給藥組,但并未顯示出協(xié)同作用。 研究表明質(zhì)粒pCSH1-V382和pCSH1-R21能夠分別特異性地抑制VEGF和VEGFR2的表達,

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