低氧刺激心肌細(xì)胞表達(dá)Jagged1及對C-KitPOS心臟干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、[目的]：
　　觀察低氧刺激對心肌細(xì)胞Notch配體Jagged1表達(dá)的影響及機(jī)制，分析低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)的Jagged1對心臟干細(xì)胞分化的影響。
　　[方法]：
　　1.采用“機(jī)械分散+酶消化”的方法分離出生72h內(nèi)的新生乳SD大鼠心肌細(xì)胞，并用“差速貼壁法”去除混雜的纖維母細(xì)胞。
　　2.基于慢病毒GV218質(zhì)粒構(gòu)建人低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒，獲得高滴度慢病毒顆粒（HIF-1

2、α-Lent和NC-Lent）。
　　3.應(yīng)用HIF-1α-Lent和NC-Lent感染乳大鼠心肌細(xì)胞后，72h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(GFP)表達(dá)，應(yīng)用定量PCR檢測Jagged1 mRNA表達(dá)。
　　4.低氧(5％O2、5％CO2、90％N2)培養(yǎng)乳SD大鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)2、4、6、8、12h后采用定量PCR檢測Jagged1mRNA表達(dá)的變化。
　　5.應(yīng)用多種信號通路的抑制劑(PD98059、SP60012

3、5、PDTC、DAPT、AG490、Stattic)處理低氧培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞8h，Western blotting檢測Jagged1蛋白的表達(dá)。
　　6.采用磁性激活細(xì)胞分選法(MACS)分選出乳SD大鼠c-KitPOS心臟于細(xì)胞（c-KitPOS CSCs），通過免疫熒光、半定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表型。
　　7.c-KitPOSCSCs以BrdU(20μmol/L)標(biāo)記后，將乳大鼠心肌細(xì)胞與c-KifPOSCSCs

4、直接接觸共培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光檢測其向心肌細(xì)胞分化的標(biāo)志基因NKX2.5的表達(dá)情況。
　　[結(jié)果]：
　　1.成功分離乳SD大鼠心肌細(xì)胞，光鏡下所見分離的心肌細(xì)胞部分呈團(tuán)蔟狀分布，胞漿透亮，細(xì)胞群搏動性良好，搏動率約為100次/份;部分心肌細(xì)胞呈單層貼壁，細(xì)胞形態(tài)為柱形，多角形。
　　2.成功構(gòu)建HIF-1α-Lent和NC-Lent，其滴度分別為1×108 TU/ml和2.0×109TU/ml。
　　3.HIF-

5、1α-Lent成功感染乳大鼠心肌細(xì)胞并顯著上調(diào)Jagged1mRNA表達(dá)。
　　4.5％ O2氧刺激短時間內(nèi)(4～6h)下調(diào)Jagged1 mRNA的表達(dá)，8h后Jagged1mRNA表達(dá)上升并處于峰值，12h仍處于高水平。HIF-1α抑制劑YC-1可拮抗低氧對Jagged1的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　5.低氧刺激下ERK抑制劑PD98059（50 nmol/L）顯著抑制心肌細(xì)胞中Jagged1表達(dá)，而JAK抑制劑AG490（25μm

6、ol/L）和STAT3抑制劑Stattic(10μmol/L)上調(diào)Jagged1蛋白的表達(dá);JNK抑制劑SP600125(25μmol/L)，Notch抑制劑DAPT（10μmol/L）和NF-κdB抑制劑PDTC(10μmol/L)對Jagged1蛋白的表達(dá)影響不明顯。
　　6.成功從乳SD大鼠心臟組織中分離出c-KitPOS CSCs，該細(xì)胞NKX2.5弱陽性，但不表達(dá)SM22α和vWF; c-KitPOS CSC表達(dá)Notc

7、h1受體。
　　7.心肌細(xì)胞與c-KitPOS CSCs直接接觸培養(yǎng)后能夠誘導(dǎo)CSC心肌樣分化，間斷低氧刺激促進(jìn)這種分化趨勢，而抑制HIF-1α和Notch信號均可減弱低氧條件下細(xì)胞共培養(yǎng)所促發(fā)的CSC心肌樣細(xì)胞分化。
　　[結(jié)論]：
　　1.低氧刺激可能通過ERK信號上調(diào)心肌細(xì)胞中Notch配體Jagged1的表達(dá)，而通過JAK/STAT3信號抑制Jagged1的表達(dá)。
　　2.心肌細(xì)胞與c-KitPOS CS