茶樹體內茶氨酸代謝及其相關酶的基礎方法研究.pdf

1、L-茶氨酸是茶樹體內特征性非蛋白質氨基酸，自1950年日本學者Sakato Y．在綠茶提取液中發(fā)現(xiàn)并鑒定以來，人們對茶氨酸的理化性質、代謝途徑、分離純化、合成方法、分析檢測、生物學活性及食品應用等諸多方面開展了廣泛而深入的系統(tǒng)研究。為進一步揭示茶樹體內茶氨酸代謝規(guī)律及生理意義，闡明各茶氨酸代謝關鍵酶在茶樹體內的催化本質，本課題進行了茶氨酸代謝及其相關酶的基礎方法研究：（1）分析了茶氨酸的紫外光譜特征，建立了茶葉中茶氨酸HPLC-PDAD

2、檢測方法；（2）研究了茶籽苗中兒茶素類、嘌呤堿類及游離氨基酸的分布規(guī)律，從而為茶氨酸代謝酶研究提供選材依據(jù)；（3）比較了不同氮素前體和黃化處理對茶籽苗兒茶素類及茶氨酸的代謝效應；（4）建立了一種茶葉游離氨基酸定量新方法-DNFB衍生化法；（5）實現(xiàn)了茶樹體內茶氨酸代謝前體及產物的HPLC同步檢測；（6）結合陽離子交換和DNFB衍生化兩種樣品預處理方法，探討了茶樹體內茶氨酸合成酶活性HPLC檢測方法的可行性；（7）開展了茶樹體內茶氨酸代謝

3、物及其代謝酶的初步研究。
　　 本論文主要獲得如下試驗結果：
　　 1．以0.05％（V/V）三氟乙酸和50％（V/V）乙腈為流動相，應用HPLC-PDAD建立了茶葉中未衍生化L-茶氨酸的分析方法。結果表明：L-茶氨酸的紫外吸收波長范圍在190-240nm之間，且在199nm具有最大吸收峰。在0.02～1.00mg/mL，范圍內，L-茶氨酸峰面積與濃度之間有良好的線性關系，回歸方程為：Y=5.8343×106X+1.82

4、01×105（r2=0.9991）。六大茶類各樣品L-茶氨酸含量RSD（％）在0.24％～1.74％之間，平均加標回收率為99.21％～101.28％。
　　 2．應用HPLC-PDAD和氨基酸自動分析儀對4～5葉初展的福云6號沙培茶籽苗各部位兒茶素類、嘌呤堿、氨基酸（茶氨酸）進行分析測定。結果表明：兒茶素類、嘌呤堿（咖啡堿、可可堿）主要分布于茶籽苗葉片及嫩莖，子葉下部含量明顯降低；EGCG、茶氨酸在茶籽苗嫩葉中含量較高，并隨葉

5、片成熟不斷減少，但茶氨酸以側根和主根最為富集，其代謝前體氨基酸（Glu、Ala）在根部亦具較高含量。隨著茶籽萌發(fā)，茶氨酸在胚根大量合成，初露紫紅色嫩莖的茶籽苗根系茶氨酸含量達13.429mg/g鮮重。據(jù)此認為培育茶籽及其無性系幼苗，并以幼嫩根系為材料，有望成為茶籽綜合利用及天然茶氨酸獲取的新途徑。
　　 3．以生育一致的去子葉福鼎大白茶籽苗及其非完整植株為材料，采用含不同氮素前體的MS培養(yǎng)液（不含氮素成分及CaCl2，蔗糖濃度為

6、15g/L）培養(yǎng)，結果表明：（1）子葉上部是兒茶素代謝豐要場所，不同氮素前體培養(yǎng)的茶苗植株子葉上部沒食子化兒茶素（EGC、GCG+EGCG）含量相對較高；以缺氮培養(yǎng)植株為對照，不同氮素前體培養(yǎng)2d和4d的茶籽苗子葉上部兒茶素組成及總量均發(fā)生或高或低的增減變化，完整植株兒茶素含量略高于非完整植株，但其培育過程中均呈減少趨勢。（2）茶苗植株的子葉下部茶氨酸含量顯著高于子葉上部；不同氮素前體培養(yǎng)2d或4d的完整植株子葉上部茶氨酸含量差異均低于

7、非完整植株，而子葉下部則表現(xiàn)為完整植株高于非完整植株；茶籽苗完整植株培養(yǎng)4d后，其子葉上部茶氨酸含量顯著低于培養(yǎng)2d的茶籽苗植株。自然光照和黃化處理的茶籽苗植株子葉下部L-茶氨酸含量并無太大差異；黃化處理可提高子葉上部L-茶氨酸的含量，但并不伴隨子葉上部兒茶素總量的降低。
　　 4．氨基酸的a-氨基能與2，4-二硝基氟苯（DNFB）發(fā)生衍生化反應，本試驗通過乙酸乙酯萃取反應體系中的氨基酸衍生物（DNP-AA），并測定其在420n

8、m的吸光值，建立了一套茶葉游離氨基酸定量新方法。該法對不同茶類分析結果與茚三酮顯色法基本一致，但具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。DNP-AA的吸光值（Y）和氨基酸濃度（X）的回歸方程分別為L-茶氨酸：Y=0.9920X+0.0036（r2=0.9998）和L-谷氨酸：Y=0.9403X-0.0008（r2=0.9995），線性范圍為0.02～1.00mg/mL。衍生化反應體系：1.0mL茶樣浸提液，1.0mL0.2mol/L NaHCO3，1

9、.0mL1％（V/V）DNFB-二氧六環(huán)溶液，充分混勻后，于60℃水浴加熱，暗處密閉反應40min，加入0.5mL1mol/L HC1終止反應。在該反應條件下，紅茶、綠茶、烏龍茶、黃茶、白茶和黑茶的平均加標回收率和相對標準偏差（RSD）分別為99.194％～101.250％和0.507％～1.299％（L-茶氨酸）、98.947％～101.840％和0.500％～1.271％（L-谷氨酸）。
　　 5．L-丙氨酸、乙胺、L-谷氨

10、酸及L-茶氨酸是茶樹體內茶氨酸代謝途徑的主要前體或產物，其在茶樹體內的分布及變化和參與其代謝的相關酶類緊密聯(lián)系。本試驗以2，4-二硝基氟苯（DNFB）為衍生化試劑，應用RP-HPLC對成品茶及茶樹鮮組織中茶氨酸代謝物進行了分析測定，結果表明：L-丙氨酸、乙胺（鹽酸乙胺）、L-谷氨酸及L-茶氨酸衍生化產物吸收波長范圍在300～500nm之間，且各標準品濃度（0.005～0.5mg/mL）與衍生化產物的吸收峰面積具有良好的線性關系（λ=36

11、0nm）；該法適用于成品茶及茶樹鮮組織中茶氨酸代謝前體及產物的同步檢測，并可獲得準確可靠的分析結果。六大茶類各待測組分以白茶、綠茶、紅茶中的L-茶氨酸含量相對較高，而在黑茶中儀檢出少量乙胺；L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-茶氨酸在茶籽苗中的含量及分布具有明顯的季節(jié)性變化，但乙胺在茶樹根系及芽葉均保持在含量較低的代謝水平。
　　 6．茶氨酸合成酶是茶樹體內茶氨酸合成代謝的關鍵酶。由于其體外催化體系成分復雜，本課題依據(jù)L-茶氨酸理化性質

12、，對茶氨酸合成酶活性HPLC檢測法進行了可行性探討，結果表明酶促反應混合體系經732陽離子交換樹脂或2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化預處理，結合RP-HPLC檢測可實現(xiàn)酶促產物（L-茶氨酸）的準確定量。去子葉茶籽幼苗（福云6號）和一芽二葉新梢（龍井43）的丙酮粉提取粗酶液可檢出微弱的茶氨酸合成酶催化活性，但茶樹組織茶氨酸去除、茶氨酸合成粗酶液的制備及其體外最適催化體系尚待深入研究。
　　 7．直接或間接參與茶氨酸代謝途徑的酶

13、類有L-茶氨酸合成酶、L-茶氨酸水解酶，谷丙轉氨酶、L-丙氨酸脫羧酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-a-酮戊二酸氨基轉移酶（亦稱谷氨酸合成酶）、胺氧化酶。本課題應用2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化-HPLC檢測法，對茶籽幼苗（去子葉）、一芽二葉新梢及茶籽苗子葉的茶氨酸代謝物進行了分析測定，結果表明各茶組織以L-茶氨酸含量最高，其次為L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，乙胺和L-丙氨酸含量較低。茶氨酸代謝酶活性檢測結果表明：一芽二葉新