預(yù)知子提取物活性成分常春藤皂苷元的抗抑郁藥理作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神疾病，表現(xiàn)為一種持久的抑郁狀態(tài)，并伴有意志消沉、思維遲鈍、言語(yǔ)減少、睡眠障礙和自殺傾向等癥狀。抑郁癥迄今已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問(wèn)題，終身患病率達(dá)15～17％。目前的抗抑郁藥物主要是合成藥，常用的傳統(tǒng)抗抑郁藥物有單胺氧化酶抑制劑(MAOI)、選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRIs）、選擇性NA再攝取抑制劑(SNRIs)和三環(huán)類(lèi)抗抑郁劑(TCA)。當(dāng)前大部分抗抑郁藥物只能緩解部分癥狀，副作用較多且伴隨起效延遲

2、的特點(diǎn)。越來(lái)越多的科研工作者將眼光投向開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁藥物。近年來(lái)，對(duì)中藥小補(bǔ)心湯黃酮類(lèi)提取物、檳榔堅(jiān)果、半夏厚樸湯、預(yù)知子提取物（Fructus Akebiae extract，F(xiàn)AE）等研究發(fā)現(xiàn)天然藥物具有一定的抗抑郁作用?！侗静菥V目》記載預(yù)知子是治療心理疾病、認(rèn)知行為缺陷，包括失眠、失憶、語(yǔ)言錯(cuò)亂、恐怖、抑郁等復(fù)雜癥候的主要處方成分。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道FAE具有抗抑郁活性，其主要成分是常春藤皂苷元（Hedera

3、genin，HG）。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究已經(jīng)證實(shí)了FAE具有抗抑郁作用，與其增強(qiáng)5-HT、DA神經(jīng)系統(tǒng)作用有關(guān)，其中FAE的主要成分HG純度大約70％。在已有研究證實(shí)FAE具有抗抑郁作用的基礎(chǔ)上，本課題通過(guò)建立細(xì)胞和多種動(dòng)物抑郁模型，對(duì)FAE主要成分HG的抗抑郁藥效進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，并且進(jìn)一步在出生8～21 d的大鼠中注射氯丙咪嗪（Clomipramine，CL）作為內(nèi)源性抑郁模型，利用大鼠慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激（Chronic Unpre

4、dictable Mild Stress，CUMS）作為外源性抑郁模型的基礎(chǔ)上，采用免疫組化(Immunohistochemical，IHC)測(cè)定CL模型各組大鼠海馬BDNF表達(dá)變化，運(yùn)用高效液相-電化學(xué)方法（HPLC-ECD）測(cè)定HG對(duì)CUMS大鼠海馬、皮層區(qū)域單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)HG對(duì)CUMS大鼠海馬、皮層BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的影響以初步明確HG可能的藥

5、理作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒副作用的天然抗抑郁藥物奠定理論基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:連續(xù)灌胃給藥14d后進(jìn)行高架十字迷宮(Elevated plus maze，EPM)以及21d后進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)(Tail suspension test，TST)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forcedswimming test，F(xiàn)ST)比較FAE(50 mg·kg-1)和HG(20 mg·kg-1)的抗抑郁活性以初步確定是否是HG發(fā)揮主要的抗抑

6、郁作用。在此基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，以皮質(zhì)酮(Cort)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立細(xì)胞模型后進(jìn)行四甲基偶氮唑藍(lán)（Methyl Thiazollyl Tetrazolium，MTT）法觀察不同濃度HG（4、8、16μmol·L-1）對(duì)PC12細(xì)胞活力和形態(tài)的影響;另外，體內(nèi)單次給藥以及連續(xù)給藥14d后，分別通過(guò)TST和FST對(duì)不同劑量HG(10、20、40 mg·kg-1)進(jìn)行抗抑郁活性的藥效學(xué)初篩，并考察HG是否影響小鼠的自主活動(dòng);

7、試劑盒測(cè)定HG對(duì)小鼠海馬超氧化物岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響;進(jìn)一步建立內(nèi)源性新生大鼠抑郁模型和外源性CUMS抑郁模型。依據(jù)行為學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)兩種抑郁模型，抑郁模型成功建立后分為正常對(duì)照組(Veh)、模型組(CUMS+Veh或CL+Veh)、陽(yáng)性對(duì)照組(ESC，5 mg·kg-1)和HG處理組(5 mg·kg-1)并連續(xù)灌胃給藥28 d，分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test，OFT)、EPM和FST評(píng)價(jià)HG對(duì)

8、內(nèi)-外源性大鼠抑郁模型的抗抑郁效果。IHC檢測(cè)HG對(duì)CL模型大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響;此外，運(yùn)用HPLC-ECD測(cè)定HG對(duì)CUMS模型大鼠的海馬、皮層區(qū)域單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)(NA，5-HT)的變化以及RT-PCR檢測(cè)BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:1、利用小鼠行為絕望模型比較FAE和HG的抗抑郁活性
　　 在行為學(xué)EPM、TST和FST測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，分別給予50 mg·kg-1 FAE和

9、20mg·kg-1 HG后，在第14天的EPM中，與Veh組相比，F(xiàn)AE和HG并沒(méi)有顯著增加開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比；而在給藥21 d后的TST和FST中，與Veh組相比，HG能顯著降低小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，F(xiàn)AE則無(wú)顯著變化，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、HG抗抑郁作用藥效的初步確定
　　 采用Cort誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立細(xì)胞模型，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Cort損傷后細(xì)胞活力顯著下降，HG處理組（4、8tmol·L

10、-1）能顯著提高細(xì)胞活力，而HG在16μmol·L-1沒(méi)有顯著改善細(xì)胞的受損程度。在倒置顯微鏡下可觀察到正常的PC12細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或纖維狀，形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)Cort損傷后，細(xì)胞皺縮呈圓形，處于懸浮狀態(tài)，細(xì)胞碎片較多。ESC、HG4和8μmol·L-1給藥處理的PC12細(xì)胞損傷程度較輕，形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞明顯增多。而HG16μmol·L-1在一定程度上改善細(xì)胞的受損程度，細(xì)胞碎片較少。
　　 小鼠TS

11、T和FST結(jié)果顯示:急性單次給藥后，與Veh組相比，HG低劑量(10 mg·kg-1)明顯縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間。連續(xù)灌胃給藥14d后，TST和FST結(jié)果顯示:與Veh組相比，HG在不影響小鼠自主活動(dòng)能力的前提下降低小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，其中低劑量具有顯著性差異。試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示:與Veh組相比，HG能提高小鼠海馬中的SOD活性，并顯著降低MDA含量。
　　 3、內(nèi)源性CL大鼠抑郁模型實(shí)驗(yàn)
　　 HG對(duì)CL大鼠體

12、重變化的影響采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組大鼠斷奶后每周稱(chēng)重，給藥前各組體重呈逐步增加的趨勢(shì);給藥后，Veh組、5mg·kg-1CL+ESC組和5 mg·kg-1 CL+HG組均比CL+Veh組表現(xiàn)出相對(duì)較高的體重增加，但各組之間無(wú)顯著性差異。給藥治療28 d后，OFT結(jié)果顯示:與Veh組相比，CL+Veh組水平得分具有降低的趨勢(shì)，而ESC和HG具有提高水平得分低的趨勢(shì);各組在垂直得分水平上均無(wú)明顯變化，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、差異。在EPM中，與Veh組比較，CL+Veh大鼠進(jìn)入開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比顯著降低，給予ESC和HG治療后具有升高開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。在FST中，與Veh組比較，CL+Veh組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著升高，而給予HG治療后能顯著降低大鼠的不動(dòng)時(shí)間。
　　 此外，從免疫組化圖像中可觀察到與Veh組相比，CL+Veh模型組海馬BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與CL+Veh模型組相比，CL+ESC、CL+HG組海馬BDN

14、F表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加。
　　 4、外源性CUMS大鼠抑郁模型實(shí)驗(yàn)
　　 HG對(duì)CUMS大鼠體重變化的影響采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周稱(chēng)重，第5周開(kāi)始，與Veh組相比，CUMS+Veh組大鼠體重顯著下降;給藥后，與Veh組比較，CUMS+Veh、CUMS+ESC、CUMS+HG各組體重均下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。行為學(xué)評(píng)價(jià)造模成功后分組，分別在給藥治療14、28 d后進(jìn)行OFT，給藥14

15、d的OFT結(jié)果顯示:各組在水平和垂直得分沒(méi)有明顯差異，慢性給藥28 d后，5 mg·kg-1 HG具有提高水平得分和垂直得分的趨勢(shì)。在EPM中，給藥28 d后，與CUMS+Veh組比較，CUMS+HG組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比顯著升高，具有顯著性差異。在FST中，與Veh組比較，CUMS+Veh組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著升高，而慢性給予ESC和HG能顯著降低大鼠的不動(dòng)時(shí)間，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 行為學(xué)結(jié)束后分別對(duì)CUMS模型大鼠海

16、馬、皮層區(qū)域單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)和BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。HPLC-ECD結(jié)果顯示:CUMS組海馬去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺(5-HT)水平顯著下降，ESC和HG均能逆轉(zhuǎn)CUMS造成NA、5-HT水平的降低，顯著升高NA、5-HT水平;而在皮層中，ESC和HG具有顯著升高NA水平，同時(shí)升高5-HT水平的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-PCR結(jié)果顯示:與Veh組比較，CUMS+Veh組海馬區(qū)域的BDN

17、FmRNA降低，與CUMS+Veh組比較， CUMS+ESC和CUMS+HG組沒(méi)有明顯變化;與Veh組比較，CUMS+Veh組5-HT1A mRNA降低，而HG具有提高5-HT1A mRNA水平的趨勢(shì)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;CUMS+Veh組5-HTTmRNA明顯升高，慢性給予ESC和HG能使之逆轉(zhuǎn)，5-HTT mRNA水平顯著下降。而在皮層中，各組之間的BDNF、5-HT1A、5-HTT mRNA表達(dá)均無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:

18、從以上結(jié)果可推測(cè)HG較FAE具有更好的抗抑郁活性，HG在體內(nèi)和體外抑郁模型中具有抗抑郁活性，其對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體氧化-抗氧化酶活性、降低過(guò)氧化損傷，保護(hù)海馬免受氧化應(yīng)激損傷起到一定的改善作用。此外，HG對(duì)內(nèi)-外源性抑郁模型動(dòng)物的焦慮/抑郁樣行為有一定的改善作用，這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT神經(jīng)系統(tǒng)，升高NA、5-HT水平，顯著降低5-HTT mRNA水平發(fā)揮抗抑郁作用。
　　 綜上所述，本課題證明了FAE的主要成分HG具有良好的抗抑郁藥效作