5-FU-殼聚糖納米粒的制備、檢測及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、殼聚糖(chitosan,CTS)是由甲殼素脫乙?；?化學(xué)名:(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。由于殼聚糖來源豐富,具有無免疫原性、無毒性、無溶血效應(yīng)、無刺激性、無熱源反應(yīng),以及良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性、抗腫瘤作用等,使其作為化療藥物載體受到了廣泛的關(guān)注,被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用前景的藥物載體。
　　5-氟尿嘧啶(5-FU)屬抗細(xì)胞代謝類抗癌藥,其抗瘤譜較廣,可用于治療消化道腫瘤、乳腺癌、皮膚癌、肺

2、癌、宮頸癌、膀胱癌及卵巢癌等。近幾年,許多學(xué)者致力于殼聚糖的抗腫瘤作用以及將其作為抗腫瘤藥物載體的研究。本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖納米粒作為藥物載體,制備成5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒(5-FU-CN)緩釋劑,檢測其一般特性,并檢測其抗卵巢癌細(xì)胞作用。
　　目的:
　　1.摸索制備5-FU-CN的實(shí)驗(yàn)條件,制備5-FU-CN并檢測其一般特性。
　　2.檢測5-FU-CN對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.檢測5-F

3、U-CN對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1.利用離子凝膠法制備5-FU-CN,摸索不同的CTS與多聚磷酸鈉(TPP)質(zhì)量比,不同質(zhì)量濃度的CTS溶液,及不同CTS與5-FU質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)體系的影響。利用掃描透射電鏡,負(fù)染條件下觀察CN及負(fù)載不同質(zhì)量5-FU的殼聚糖納米粒的外形特征。利用體外透析的方法,檢測裸藥5-FU和5-FU-CN的釋放特點(diǎn)。
　　2.利用倒置顯微鏡觀察5-FU-CN作用于卵巢癌A2

4、780細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;利用MTT法,檢測5-FU-CN對(duì)A2780細(xì)胞的生長抑制作用,并與裸藥5-FU和空白殼聚糖納米粒(CN)進(jìn)行比較;利用流式細(xì)胞儀檢測5-FU-CN作用于A2780細(xì)胞后,對(duì)其細(xì)胞周期分布的影響;利用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測5-FU-CN對(duì)A2780細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響。
　　3.利用流式細(xì)胞儀檢測5-FU-CN作用于A2780細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;利用TUNEL法進(jìn)一步檢測5-FU-CN對(duì)細(xì)胞凋

5、亡的影響;利用RealTimePCR方法檢測CN對(duì)A2780細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(caspase-3,caspase-8,bax,bcl-2)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.固定CTS的濃度為1mg/mL,隨著CTS與TPP質(zhì)量比的增加,反應(yīng)體系混合液逐漸渾濁,同樣固定CTS與TPP的質(zhì)量比為5:1,隨著CTS溶液質(zhì)量濃度的增加,反應(yīng)體系溶液出現(xiàn)絮凝、甚至出現(xiàn)渾濁。根據(jù)對(duì)反應(yīng)條件的摸索,制備CN及5-FU-CN時(shí),選擇CTS的質(zhì)量

6、濃度為5mg/mL,CTS與TPP的質(zhì)量比為5:1,CTS與5-FU的質(zhì)量比為1:1。用透射電子顯微鏡觀察,CN為規(guī)則的圓形,表面光滑,其粒徑大小在30~60nm范圍內(nèi),具有良好的穩(wěn)定性和分散性。包埋5-FU后,納米粒的粒徑隨著所含5-FU質(zhì)量比例增大而增大,且粒徑的分布范圍變大。體外透析實(shí)驗(yàn)證明:裸藥5-FU不存在緩釋效應(yīng),而負(fù)載于殼聚糖納米粒后,5-FU-CN具有一定的緩釋效應(yīng),緩釋時(shí)間可長達(dá)120h左右。
　　2.倒置顯微鏡

7、下觀察,5-FU-CN作用于A2780細(xì)胞后,出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少,胞質(zhì)濃縮,部分細(xì)胞體積明顯縮小,輪廓不規(guī)則,生長緩慢,隨著作用時(shí)間的延長,出現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞死亡。MTT實(shí)驗(yàn)顯示5-FU-CN對(duì)A2780細(xì)胞具有一定的生長抑制作用,且呈濃度-時(shí)間依賴性。與裸藥5-FU相比,在藥物作用24h之前,5-FU-CN對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A2780細(xì)胞的生長抑制作用弱于裸藥5-FU,但在24h之后,5-FU-CN對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用強(qiáng)于裸藥5-FU,且差異

8、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。間接證明了5-FU-CN的緩釋作用。5-FU-CN能夠明顯抑制A2780細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)(P<0.05)。與此同時(shí)5-FU負(fù)載于殼聚糖納米粒后,使處于S期細(xì)胞比例下降,G1期細(xì)胞比例增加,隨著時(shí)間的延長,5-FU-CN將細(xì)胞抑制于G1期的作用更加明顯。
　　3.流式細(xì)胞儀及TUNEL法檢測結(jié)果均證明:5-FU-CN能誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生凋亡。裸藥5-FU與5-FU-CN相比

9、,在作用24h,5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于5-FU-CN,在作用48h,5-FU-CN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力超過5-FU,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。5-FU-CN能夠上調(diào)A2780細(xì)胞中caspase-8、caspase-3、baxmRNA表達(dá)量,下調(diào)bcl-2mRNA表達(dá)量。雖然5-FU-CN對(duì)基因的調(diào)控速度相對(duì)裸藥5-FU較慢,但是其調(diào)控能力強(qiáng)大,且作用持久。
　　結(jié)論:
　　1.利用離子凝膠法,選擇殼聚糖的質(zhì)量

10、濃度為5mg/mL,殼聚糖與多聚磷酸鈉的質(zhì)量比為5:1,殼聚糖與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為1:1,能夠制備出穩(wěn)定性及分散性好、粒徑分布均一的納米粒。
　　2.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒中的5-氟尿嘧啶具有藥物緩釋性能,其緩釋過程分為突釋階段和緩釋階段兩部分,緩釋時(shí)間可持續(xù)120個(gè)小時(shí)左右。
　　3.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞具有生長抑制作用,呈現(xiàn)濃度-時(shí)間依賴性,且其抗腫瘤作用明顯強(qiáng)于裸藥5-氟尿嘧啶及空白

11、殼聚糖納米粒。雖然5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒對(duì)A2780細(xì)胞的生長抑制作用在早期不及裸藥5-氟尿嘧啶,但隨著作用時(shí)間的延長,其抗腫瘤效果明顯增強(qiáng)并超過裸藥5-氟尿嘧啶,間接證明了5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒的藥物緩釋作用。
　　4.5-氟尿嘧啶經(jīng)殼聚糖包埋后能夠增加其對(duì)A2780細(xì)胞G1期的抑制作用,與此同時(shí)能抑制A2780細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白表達(dá),從而起到抑制A2780細(xì)胞增殖的作用。
　　5.5-氟尿嘧啶-殼聚糖納米粒能誘導(dǎo)