三倍體虹鱒卵巢敗育的調控機制研究.pdf

1、虹鱒（Onchorynchus mykiss），屬于鮭形目(salmoniformes)，鮭科(salmonidae)，大麻哈魚屬（Oncorhynchus）。該魚是FAO向世界推薦的高品質養(yǎng)殖對象之一，也是我國最主要的鮭鱒魚引進品種和養(yǎng)殖對象。由于三倍體雌性虹鱒在鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)中顯示了諸多優(yōu)點，如性腺不發(fā)育、肌肉品質好等。因此，以全雌三倍體虹鱒作為鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主力品種已成為大勢所趨。
　　眾所周知，鮭科魚類即便多出一套甚至兩

2、套染色體也能夠生存和繁殖，這是其他脊椎動物不具有的特性。四倍體和雄性三倍體虹鱒與二倍體虹鱒性腺具有相同結構與功能，然而，三倍體雌性虹鱒是一個例外，早期卵巢呈線狀，并且缺少初級卵母細胞。因此，三倍體虹鱒的性別分化與發(fā)育機制之間的本質區(qū)別成為了研究焦點。盡管與性別決定和分化的相關基因在二倍體虹鱒中已被鑒定出來，如sdY、Dmrt1、Cyp19a1a、Foxl2和Sox9等，但關于三倍體雌性虹鱒獨特性腺表型及其相關性別控制基因的表達規(guī)律仍未得

3、到深入研究，尤其是早期卵巢發(fā)育阻滯導致的生殖細胞去分化特征。因此，本研究以三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育中起重要調控作用的特異候選基因作為重點研究對象，輔助性腺體細胞與生殖細胞分化方向的組織學證據和類固醇激素表達規(guī)律，并通過外源性激素誘導，對三倍體雌性虹鱒的性腺表型發(fā)育進行預期調控，驗證各基因間的級聯調控關系以及與性細胞重塑和性類固醇激素消長規(guī)律間的互作效應，揭示雌性三倍體虹鱒卵巢敗育及其天然性轉變的發(fā)生機制與調控機理。主要研究結果如下:

4、>　　(1)虹鱒三倍體與二倍體卵巢的分化特征基本一致。虹鱒二倍體與三倍體性腺分別在84dpf和98 dpr已分化為卵巢。但三倍體虹鱒卵巢分化存在障礙，早期發(fā)育停滯，卵原細胞及其濾泡細胞數量有限。在154～574 dpf時期，二倍體虹鱒卵巢中充滿卵母細胞，而三倍體卵巢缺少相當數量卵母細胞，卵巢呈線狀，且在之后的發(fā)育期里一部分雌性生殖細胞開始去分化。在964 dp耐期，雌性三倍體性腺發(fā)生組織重構，并出現再分化現象，性腺中有類似于產精子樣細胞

5、囊存在，這些細胞顯得比卵原細胞略小，與二倍體精巢分化早期生殖細胞相似。
　　(2)在334～964 dpf時期，二倍體兩性虹鱒血清中雌二醇和睪酮含量均呈逐漸升高的趨勢變化，雌性血清雌二醇含量為50～650 pg/ml，較雄性高5～8倍;雄性血清睪酮含量為20～180ng/ml，較雌性高10～25倍。雌性三倍體虹鱒血清雌二醇含量呈先升高后降低趨勢變化，但其含量始終沒能達到二倍體水平，峰值為110 pg/ml(574 dpf);雌性三

6、倍體睪酮含量呈逐漸升高趨勢變化，在發(fā)育后期幾乎達到了二倍體雄性水平。隨著雌性三倍體虹鱒性腺發(fā)育，卵巢退化較為嚴重，導致雌激素代謝通路受阻，當精巢支持細胞出現，睪酮被轉化為雌二醇的量大大降低。
　　(3)在154～964 dpf時期，分別以二倍體雌、雄虹鱒作為同期基礎對照，采用RT-PCR技術對雌性三倍體虹鱒性腺特異基因進行差異化表達分析。研究結果表明，除Dax1外，在二倍體和三倍體虹鱒性腺中均獲得了Cyp19a1a、Foxl2、s

7、dY，Dmrt1、Amh和Sox9的表達譜。在雌性三倍體虹鱒性腺中，Cyp19a1a和Foxl2表達量均呈先升高后降低趨勢，并顯著低于在二倍體卵巢中的表達水平(P＜0.05)，只有在154～574 dpf時期，這兩個基因表達量顯著上調（P＜0.05），但他們在整個發(fā)育期都顯著高于在二倍體精巢中的表達水平（P＜0.05）;sdY和Dmrt1表達量均呈先升高后降低趨勢變化，Amh和Sox9表達量均呈逐漸上調趨勢，這些基因在574～964 d

8、pf時期均顯著高于在二倍體卵巢中的表達水平（P＜0.05）。在發(fā)育早期，雌性三倍體虹鱒sdYDmrt1表達量顯著低于在二倍體精巢中的水平（P＜0.05），但在574 dpf時期他們的表達量達到最高，且sdY表達量顯著高于二倍體雄性水平（P＜0.05）;盡管在574～964 dpf時期，Amh和Sox9的表達量較二倍體雌性虹鱒高數百倍，但他們的表達仍極顯著低于在二倍體精巢中的水平(P＜0.05)。因此，本研究認為，Cyp19a1a和Fox

9、l2不斷被下調或抑制，是導致雌性三倍體卵巢敗育主要因素之一。
　　(4)三倍體雌性虹鱒經歷了卵巢發(fā)育停滯、性腺結構重組和性轉變過程。在幼魚期，三倍體雌性虹鱒血清雌二醇含量最高，且Foxl2和Cyp19a1a表達量持續(xù)上調，而sdY、Dmrt1、Amh和Sox9表達量均相對較低，血清睪酮含量也處于較低水平。但隨著進入成年期發(fā)育(784～964 dpf)，僅靠雌激素已無法誘導Foxl2持續(xù)高表達，而Cyp19a1a的表達水平也隨之急劇

10、下調;該時期sdY、Amh和Sox9均持續(xù)高表達，sdY甚至達到了同期二倍體雄性的表達水平，而Foxl2和Cyp19a1a表達急劇下調直至微量表達。
　　(5)本研究是第一次在三倍體雌性虹鱒上設計實驗，外源性雄激素和雌激素采用虹鱒養(yǎng)殖業(yè)中的通常劑量。芳香化酶抑制劑（1，4，6-androstatriene-3，17-dione，ATD）處理成功誘導了精巢分化，其發(fā)育模式與二倍體雄性的趨于一致，但精巢發(fā)育速度較慢，不過沒影響其自然生

11、理應答。17α-甲級睪丸酮(17α-methyltestosterone，MET)處理不但沒能產生雄性化誘導效應，還將遺傳為雌性的性腺始終抑制在低分化水平，嚴重阻礙了性腺向任何一個方向發(fā)展的可能。因此本研究認為，三倍體化改變了雌性虹鱒自身雄性化誘導通路的作用機制。ATD誘導與性腺重構的雙重作用觸發(fā)了雌性向雄性逆轉，而之后進入精巢發(fā)育模式。在三倍體虹鱒卵巢去分化和再分化期進行雌激素回救處理，并不能有效促進或維持卵巢發(fā)育。
　　(6)

12、本研究依據雌-雄性轉化生物模型來了解三倍體雌性虹鱒的性腺分化特點及其候選基因表達譜，探索當基因組被放大后，雄性化處理對某些在二倍體中微量表達的基因的影響效應，驗證性腺特異基因在卵細胞發(fā)生去分化和再分化過程中的調控機制。通過總體表達譜可知，在整個發(fā)育過程中Cyp19a1a和Foxl2的表達均被ATD所抑制，甚至在發(fā)育后期這兩個典型的雌性基因也沒能得到有效恢復。由于雌性基因不斷被下調或抑制，導致了卵巢敗育，并使卵細胞去分化返回到性原細胞時期

13、;隨著sd，和Dmrt1表達量不斷上調，激活了性原細胞再分化為雄性生殖細胞，并在Sox9和Amh協同作用下，開啟了精巢分化模式。MET在三倍體雌性分化過程中不具有對Cyp19a1a和Foxl2的抑制效應，反而是對其產生了增量調節(jié)，盡管同時也上調了其他雄性特異基因，但由于雌性分化通路并未被完全破壞，導致了雄性化處理失敗。在雌性三倍體性腺去分化和再分化時期，外源性雌二醇處理破壞了Foxl2與Cyp19a1a級聯調控關系，并始終抑制Cyp19

14、a1a表達。由于濾泡層退化或消失，雌性基因絕對數量驟減，進而導致內源性雌激素合成不足。由于原本Cyp19a1a表達量就處于較低水平，再加之外源性雌激素強烈抑制，加劇了卵細胞的去分化進程，甚至在再分化期外源性雌激素有促進雄性特異基因表達的情況。說明雌性分化通路中雌激素與Foxl2和Cyp19a1a之間確實存在反饋調控關系。
　　綜上所述，本研究得到以下結論:(1)三倍體虹鱒卵巢分化同樣由Cyp19a1a與Foxl2共同參與啟動，而且

15、受雌激素調控較為明顯;在其卵巢敗育時期，sdY和Dmrt1聯合調控作用將導致雌性化通路的Cyp19a1a與Foxl2的表達失調，而在性轉變時期，Sox9和Amh顯著上調將對sdY和Dmrt1表達產生抑制效應。(2)三倍體虹鱒內源性雌激素缺乏是導致卵巢發(fā)育失敗的關鍵因素。(3)三倍體化破壞了虹鱒雌性化通路的調控機制，導致其內源性雌激素合成能力不斷下降，進而卵巢發(fā)育失敗，并最終發(fā)生了天然雄性化逆轉現象。(4)卵細胞去分化過程對于Cyp19a