多胺氧化酶在脫落酸誘導(dǎo)玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)中的作用.pdf

1、植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)可以調(diào)節(jié)植物抗逆(包括干旱、冷害、鹽害等)的多種生理反應(yīng)和分子生物學(xué)效應(yīng)。過(guò)去的研究結(jié)果已經(jīng)表明ABA能夠誘導(dǎo)過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)產(chǎn)生以及抗氧化基因的表達(dá)，但有關(guān)ABA誘導(dǎo)植物抗氧化防護(hù)能力提高的詳細(xì)機(jī)制仍有許多問(wèn)題尚不清楚。多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)是一種主要分布在禾谷類等單子葉植物中的胺氧化酶。它分子中含有黃素蛋白

2、(flavoprotein，F(xiàn)AD)，能將細(xì)胞產(chǎn)生的胺類物質(zhì)(如亞精胺和精胺)氧化成醛，并釋放NH3和H2O2。目前關(guān)于PAO的研究多集中于其在細(xì)胞壁硬化以及程序性細(xì)胞死亡中的作用，有關(guān)ABA誘導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生中，PAO的貢獻(xiàn)及功能研究還非常少，特別是PAO對(duì)亞細(xì)胞區(qū)室細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以玉米(Zea mays L.)葉片為材料，應(yīng)用組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)、酶活性分析以及半定量RT-PCR相結(jié)合的手段

3、，進(jìn)一步研究玉米多胺氧化酶(maize polyamine oxidases，MPAO)是否參與ABA誘導(dǎo)的玉米葉片中H2O2產(chǎn)生及其在細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)的作用。主要的研究結(jié)果如下： 采用半定量RT-PCR的方法，100μM ABA處理后，玉米葉片中MPAO基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照相比，在10 min至20 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)快速、瞬時(shí)的上調(diào)；另一方面，相對(duì)于對(duì)照組，質(zhì)外體MPAO活性在ABA處理后迅速上升，在0.5 h達(dá)到最大后開(kāi)始下

4、降，即外源ABA處理能誘導(dǎo)其基因表達(dá)和酶活性的提高。 DAB在過(guò)氧化物酶催化下能與H2O2反應(yīng)生成深棕色的多聚化合物。本研究用DAB染色檢測(cè)H2O2量的變化來(lái)揭示MPAO在外源ABA誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生中的作用。從組織化學(xué)圖片中可以看出，在外源ABA的處理下則迅速地引起了玉米葉片H2O2的大量積累。分別采取MPAO的兩種抑制劑，并結(jié)合ABA處理來(lái)觀察它們對(duì)外源ABA誘導(dǎo)玉米葉片H2O2積累的影響。結(jié)果表明不同濃度的兩種抑制劑(0.

5、1，0.5和1 mM)均對(duì)ABA誘導(dǎo)的玉米葉片H2O2的積累有一定抑制作用。 用細(xì)胞化學(xué)方法來(lái)進(jìn)一步揭示MPAO在外源ABA誘導(dǎo)H2O2積累中的作用。電鏡照片表明，在外源ABA處理?xiàng)l件下，玉米葉肉細(xì)胞位于朝向細(xì)胞間隙的細(xì)胞壁上有大量的黑色沉積物，表明外源ABA誘導(dǎo)質(zhì)外體產(chǎn)生大量的H2O2。抑制劑實(shí)驗(yàn)中，guazatine和DADD處理后葉肉細(xì)胞壁上的沉積物明顯減少，這與組織化學(xué)的結(jié)論是一致的。而抑制劑預(yù)處理8n后結(jié)合純水處理，未

6、發(fā)現(xiàn)在玉米葉肉細(xì)胞質(zhì)外體有H2O2的產(chǎn)生，表明抑制劑本身對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。MPAO酶活性結(jié)合半定量RT-PCR分析以及組織化學(xué)結(jié)合細(xì)胞化學(xué)方法的研究進(jìn)一步提示，MPAO可能參與了ABA誘導(dǎo)的玉米葉片H2O2的產(chǎn)生，MPAO是玉米葉片中活性氧的來(lái)源之一。 研究表明，ABA上調(diào)了玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)酶SOD，APX的活性。為了明確MPAO與玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)的關(guān)系，本研究用MPAO抑制劑guazatine和DADD

7、預(yù)處理8h，再用100μM ABA處理8h或12 h來(lái)進(jìn)行研究。結(jié)果表明這兩種抑制劑均部分抑制ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶cAPX和SOD4基因的表達(dá)以及細(xì)胞溶質(zhì)APX和SOD活性的提高，并且抑制劑濃度越高抑制程度越明顯。這提示MPAO可能參與了ABA誘導(dǎo)玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。 為了進(jìn)一步明確MPAO對(duì)玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的影響，用MPAO的最適底物(Spd，Spm)處理玉米離體植株。1 mM Spd處理引

8、起了細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)能力的提高。外源多胺處理提高了離體玉米植株抗氧化防護(hù)基因cAPX和SOD4的表達(dá)，也提高了細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)酶APX，SOD的活性。另一方面，MPAO抑制劑(guazatine、DADD)和H2O2清除劑(CAT、DMTU)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制劑或清除劑均明顯抑制了多胺誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶cAPX和SOD4基因表達(dá)以及細(xì)胞溶質(zhì)APX和SOD活性的提高，并且抑制劑濃度越高抑制程度越明顯。這說(shuō)明MPAO是通過(guò)分解多胺產(chǎn)生的