水牛瘤胃纖毛蟲分子生態(tài)研究初探.pdf

1、目的：以水牛瘤胃纖毛蟲18S rRNA保守區(qū)基因序列為研究對象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)分析水牛瘤胃纖毛蟲種群的遺傳多樣性。 方法：1、利用蛋白酶K法對水牛瘤胃微生物總DNA基因進行有效地提取。 2、對水牛瘤胃纖毛蟲18SrRNA基因PCR擴增方法的比較與優(yōu)化。由于需要采用特殊的帶有“GC夾”結(jié)構(gòu)的引物，所以分別采用常規(guī)PCR及降落式PCR對水牛瘤胃纖毛蟲18S rRNA基因進行擴

2、增，并用復(fù)原條件PCR去除原PCR產(chǎn)物中的異源雙鏈和單鏈DNA分子。 3、通過變性梯度凝膠電泳技術(shù)對擴增的水牛瘤胃纖毛蟲18S rRNA基因進行分離，分析水牛瘤胃纖毛蟲種群的遺傳多樣性。 結(jié)果：1、利用蛋白酶K消化液消化的方法對水牛瘤胃總微生物細胞進行裂解消化，可以有效地提取水牛瘤胃微生物總DNA。 2、對于引物含有“GC夾”的PCR擴增，降落式PCR提高了擴增反應(yīng)的特異性和擴增產(chǎn)物的得率，降低了錯配現(xiàn)象的產(chǎn)生；

3、通過復(fù)原條件PCR對降落式PCR擴增產(chǎn)物進行進一步地擴增，去除降落式PCR擴增產(chǎn)物中的異源雙鏈和單鏈DNA分子，保證后續(xù)變性梯度凝膠電泳技術(shù)分離與分析的準(zhǔn)確性。 3、通過變性梯度凝膠電泳技術(shù)分離水牛瘤胃纖毛蟲發(fā)現(xiàn)瘤胃纖毛蟲種群復(fù)雜多樣，但沒有明顯的宿主特異性。經(jīng)同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所測定的纖毛蟲18S rRNA序列之間的同源性在90％以上，與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的瘤胃纖毛蟲18S rRNA克隆體的同源性在97％-100％之