降纖酶制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究.pdf

1、本文以中國長白山白眉蝮蛇蛇毒為原料，根據(jù)蛇毒的生物學(xué)特征，采用不同方法對(duì)蛇毒的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，并對(duì)降纖酶分離純化的生產(chǎn)工藝以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。 采用三種不同介質(zhì)sourse15Q，sourse15S，sourse30S進(jìn)行離子交換色譜分離，能有效除去雜蛋白，保留活性組分。其中Sourse30具有低壓系統(tǒng)分辨率很高、成本低的特點(diǎn)。用Heparin-sepharoseCL-4B，Heparin-sepharoseCL-6B，Hep

2、arinsepharose6FastFlow三種親和介質(zhì)分離，得到的色譜圖譜基本一致，為一個(gè)峰，對(duì)降纖酶的分離能力無差別，考慮到生產(chǎn)中的成本，選用價(jià)格比較低的Heparin-SepharoseCL-6B。將得到降纖酶粗品，采用Sourse15PHE，Sourse15ETH，Sourse15IS0三種介質(zhì)進(jìn)行疏水分離，各得到兩個(gè)峰?；钚詸z測(cè)表明，第二個(gè)峰為活性峰，Sourse15PHE活性組分的活性比另外兩種介質(zhì)得到的活性組分高。在此基礎(chǔ)

3、上采用凝膠介質(zhì)Superdex200，Superdex30，Superdex75分離，得到分離峰相似，都是一個(gè)具有活性的洗脫峰。其中Superdex75具有低非特異性吸附，提高回收率，分辨率、選擇性高。 經(jīng)過介質(zhì)篩選和工藝參數(shù)的小試研究，對(duì)工藝生產(chǎn)進(jìn)行放大。最終經(jīng)過離子交換，親和色譜，經(jīng)過濾除菌，疏水色譜分離，再超濾，凝膠色譜分離。得到的活性峰，經(jīng)高效液相色譜分析，其純度達(dá)99.0％以上，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示為一條單成

4、份帶，分子量為36500。該分離純化方法經(jīng)過實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，具有工藝過程簡單，在生產(chǎn)過程中除去了神經(jīng)毒、出血毒及其它有害毒素，與國內(nèi)同類產(chǎn)品比較，具有降纖酶純度高，副作用小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。 參照2000年中國藥典，對(duì)降纖酶理化性質(zhì)進(jìn)行分析與檢測(cè)，并進(jìn)行穩(wěn)定性考察。經(jīng)觀察和檢測(cè)，在36個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，本品的有效期定為2年。為此，建立本產(chǎn)品的質(zhì)量控制指標(biāo)。與目前臨床使用的t-PA，尿激酶，鏈激酶等溶栓制劑相比，蛇毒纖溶酶有其優(yōu)點(diǎn)，可