結(jié)直腸癌中TCF21調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Kiss-1表達的研究.pdf

1、目的:
　　1、分析腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TCF21與Kiss-1對結(jié)直腸癌臨床病理特性的影響;探討二者表達情況的相關(guān)性。
　　2、分析siRNA沉默結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞株TCF21基因?qū)iss-1基因表達水平的影響,并觀察受抑制后細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力等生物學(xué)行為的變化。
　　方法:
　　1、采用免疫組織化學(xué)法檢測71例結(jié)直腸癌原發(fā)病灶及其相應(yīng)癌旁正常組織中TCF21與Kiss-1基因蛋白的表達情況。
　

2、　2、采用實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)法從結(jié)直腸癌細(xì)胞株Lovo,SW480,HT-29中篩選出TCF21與Kiss-1基因mRNA的表達水平均相對較高者,備用。
　　3、設(shè)計3條siRNA-TCF21干擾分子片段,利用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞株;采用qRT-PCR法檢測48h后TCF21mRNA表達水平的變化情況,篩選出干擾抑制

3、效率最高的分子片段;采用免疫印跡(Western-blot)法檢測該片段轉(zhuǎn)染72h后TCF21蛋白的表達水平,鑒定TCF21基因的沉默效果。4、TCF21基因成功沉默后,同時檢測該組干擾48h及72h后Kiss-1基因mRNA與蛋白表達水平的變化情況。
　　5、將該siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞株,采用CellCountingKit-8(CCK8)法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖能力;Transwell小室法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲及

4、遷移能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1、結(jié)直腸癌原發(fā)病灶中TCF21與Kiss-1基因的陽性表達率分別為66.20％與70.42%,均明顯低于癌旁正常組織的91.55%與94.37%(P<0.001);且二者的表達水平均與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處器官及臨床TNM分期有關(guān)(P<0.05);但與患者的性別、年齡、分化程度、病理類型、侵潤深度、脈管內(nèi)癌栓、瘤體大小、壞死等無關(guān)(P>0.05);二者的表達存在著明顯的正相關(guān)性(r=0.4

5、50,P<0.05)。
　　2、結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29中TCF21與Kiss-1基因mRNA的表達水平均相對高于SW480,Lovo細(xì)胞株。
　　3、轉(zhuǎn)染了siRNA的HT-29細(xì)胞3組,si1組中TCF21mRNA與蛋白的表達水平均明顯降低,與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),TCF21基因被成功沉默。
　　4、si1組中Kiss-1mRNA和蛋白的表達水平亦明顯降低,與對照組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.

6、05),Kiss-1基因的表達被下調(diào)。
　　5、siRNA成功沉默HT-29細(xì)胞后,CCK-8法顯示細(xì)胞增殖能力明顯增強(P<0.01);Transwell小室實驗顯示,細(xì)胞侵襲及遷移能力亦明顯增強(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、TCF21與Kiss-1基因的表達存在著明顯的正相關(guān)性,二者的表達缺失與結(jié)直腸癌的進展過程密切相關(guān),并可能是結(jié)直腸癌遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險增高的促進因素。
　　2、沉默結(jié)直腸癌HT-29細(xì)