CHOP在急性缺血性腎損傷炎癥反應(yīng)中的作用及機制.pdf

1、多種原因引起的缺血性急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是臨床危重癥之一，有關(guān)AKI的發(fā)生機制一直是腎臟病領(lǐng)域關(guān)注的重要科學(xué)問題。目前認為，AKI也是一種炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的疾病，但缺血再灌注啟動腎組織炎癥反應(yīng)的機制尚不完全清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞胞漿中最大的細胞器，負責蛋白質(zhì)合成、組裝和修飾等重要功能，發(fā)揮調(diào)控細胞存活和正常功能的重要作用。已證實，缺血、缺氧、能量匱乏等損傷因素可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一系列伴侶蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶

2、等分子激活進而啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究表明，適宜的ERS可維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮保護細胞效應(yīng)，而當損害因素過重或持續(xù)時間過長則導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose Regulated Proteins78，GRP78)、氧調(diào)節(jié)蛋白150(oxygen-regulated protein150，ORP150)表達上調(diào)被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志。研究發(fā)

3、現(xiàn)，在腎臟動脈夾閉10分鐘，腎組織即可發(fā)生強烈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并引起腎小管上皮細胞凋亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，過度ERS不僅引起細胞凋亡，與炎癥反應(yīng)的關(guān)系也十分密切。CHOP又稱生長停滯及DNA損傷基因153(growth arrest and DNA damage induciblegene153，GADD153)，是分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重要促凋亡分子，最近研究發(fā)現(xiàn)CHOP活化還具有促進炎癥反應(yīng)的作用，例如在CHOP基因敲除小鼠LPS誘導(dǎo)的肺炎以及胰腺炎

4、動物模型中炎癥細胞因子釋放和組織損傷明顯輕于野生型小鼠。本研究觀察腎臟缺血再灌注損傷時CHOP的變化規(guī)律及其與腎組織炎癥反應(yīng)的關(guān)系，為闡明急性腎損傷發(fā)生機理提供新的理論依據(jù)。 一、實驗方法 1、腎缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥細胞因子的表達 采用雙腎蒂夾閉缺血再灌注(ischemia- reperfusion，I/R)損傷模型。即用無損傷動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂40min后放開雙側(cè)動脈夾再灌注。分別在1、6、12、2

5、4 h后檢測血Cr、BUN水平。行腎組織PAS染色評估腎組織損傷，分別以熒光定量RTPCR、免疫組化和Western blot方法檢測腎組織GRP78、CHOPmRNA和蛋白質(zhì)表達。ELISA法檢測腎組織IL-1β、IL-6和IL-8水平變化。 2、H2O2誘導(dǎo)HKC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥細胞因子的表達 細胞在含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達95％時換用無血清DMED同步化16 h后

6、。分別以50、100、200、500umol，1、5mmol H2O2刺激HKC4 h，收集上述各組HKC和對照組HKC及其培養(yǎng)上清。以100umol H2O2刺激HKC，分別于1h、2h、4h、8h、12 h及16 h收集HKC和培養(yǎng)上清。培養(yǎng)上清LDH水平檢測按試劑盒說明書進行，MTT法檢測細胞存活率。ELISA檢測培養(yǎng)液中11-1β、IL-6、IL-8水平。分別以熒光定量RTPCR，Western blot檢測細胞GRP78、CH

7、OP、IL-1β、IL-6、IL-8mRNA和蛋白水平的變化。 3、CHOP過表達和CHOP基因沉默對H2O2誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎性細胞因子表達的影響 分別以脂質(zhì)體LipofectamineTM20005μl加PEGFP-CHOP4μg、PEGFP-N14μg、CHOPsiRNA8ul、對照siRNA8ul轉(zhuǎn)染HKC24 h后，熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。以熒光定量RTPCR和Western blot方法分別檢測各組細胞C

8、HOPmRNA和蛋白表達。 分別以100umol H2O2刺激HKC細胞12 h，細胞分為HKC組、HKC+H2O2組；CHOPsiRNA+H2O2組、對照siRNA+H2O2組；PEGFP-CHOP+H2O2組、PEGFP-N1+H2O2組。同法測定培養(yǎng)上清LDH水平，細胞存活率、IL-1β、IL-6、IL-8水平、CHOPmRNA和蛋白水平的變化。 二、結(jié)果 1、I/R可誘導(dǎo)腎組織CHOP表達上調(diào)和激活炎癥反

9、應(yīng) 與假手術(shù)組比較，大鼠I/R1 h，血Cr水平明顯升高，腎小管損傷評分1.17，腎組織IL-1β、IL-6、IL-8水平開始明顯升高；I/R12 h時，上述指標升高達高峰。說明I/R可導(dǎo)致腎組織損傷并啟動炎癥反應(yīng)。大鼠I/R1 h，免疫組化檢測顯示腎小管上皮細胞GRP78和CHOP表達上調(diào)；熒光定量RT-PCR、Western blot方法檢測顯示，腎組織GRP78和CHOP mRNA及其蛋白表達均明顯升高。相關(guān)分析表明，腎小

10、管損傷評分、炎癥因子水平分別與CHOP表達呈顯著正相關(guān)。 2、H2O2可刺激HKC CHOP和炎癥因子的表達 體外試驗發(fā)現(xiàn)，H2O2剌激HKC后，隨著H2O2濃度增加或刺激時間延長，細胞上清LDH水平升高，存活率下降，培養(yǎng)上清IL-1β、IL-6、IL-8水平升高。細胞GRP78和CHOP mRNA及其蛋白水平升高，IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA表達升高。CHOP蛋白表達分別與炎癥因子蛋白水平、LDH水平呈顯著

11、正相關(guān)。 3、增強或抑制CHOP表達能增加或減少炎癥因子的表達 轉(zhuǎn)染PEGFP-CHOP的HKC細胞在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光信號。轉(zhuǎn)染PEGFP-CHOP的HKC細胞CHOP蛋白、mRNA表達顯著高于對照組。轉(zhuǎn)染CHOPsiRNA的細胞CHOP蛋白、mRNA表達顯著低于對照組。 PEGFP-CHOP轉(zhuǎn)染的HKC細胞與100umol H2O2孵育12 h后，培養(yǎng)上清LDH水平升高，細胞存活率降低；細胞培養(yǎng)上

12、清中IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著高于PEGFP-N1+H2O2組和HKC+H2O2組。轉(zhuǎn)染CHOP siRNA的HKC細胞與100umol H2O2孵育12 h后，LDH漏出量降低，細胞存活率升高；細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著低于對照siRNA+H2O2組和HKC+H2O2組。 三、結(jié)論 I/R和H2O2可上調(diào)腎組織和培養(yǎng)的腎小管上皮細胞CHOP表達，同時增強炎癥細胞因子的產(chǎn)生和釋放。過