腰椎間盤(pán)突出癥的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:腰椎間盤(pán)突出癥是一種引起下腰痛和坐骨神經(jīng)痛的常見(jiàn)骨科疾病。國(guó)內(nèi)外從細(xì)胞因子上及遺傳學(xué)上對(duì)椎間盤(pán)突出癥的機(jī)制的研究非常多，目前主要認(rèn)為腰椎間盤(pán)突出癥是由于椎間盤(pán)物理因素改變引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，從而引起髓核細(xì)胞凋亡，繼而導(dǎo)致多因子功能改變而引起一系列表現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究腰椎間盤(pán)突出癥多數(shù)從一兩個(gè)基因或者細(xì)胞因子著手，而腰椎間盤(pán)突出癥即是多因素協(xié)同作用的結(jié)果，因此，至今腰椎間盤(pán)突出癥的詳細(xì)機(jī)制目前尚不十分明了。蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生，使人們

2、能直接從蛋白質(zhì)表達(dá)水平上揭示細(xì)胞、組織的表達(dá)豐度及其功能，克服了以往在DNA或RNA水平研究基因表達(dá)的缺陷——基因表達(dá)與DNA或RNA改變的不對(duì)應(yīng)性，進(jìn)而能夠在細(xì)胞和生命有機(jī)體的整體水平闡明生命的本質(zhì)和疾病形成的機(jī)制。 在本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)尋找椎間盤(pán)突出癥患者和正常人的血清差異蛋白，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。筆者希望所證實(shí)的差異蛋白能作為腰椎間盤(pán)突出癥的生物標(biāo)志物以及成為該疾病靶向治療的位點(diǎn)。

3、材料與方法: 1、晨起空腹條件下采集腰椎間盤(pán)突出癥患者和健康志愿者靜脈血2ml，離心后收集血清，在每個(gè)樣本上加入蛋白酶抑制劑，然后分離血清樣本保存在—80℃?zhèn)溆谩?0微升血清樣本放入1mL的離心管里面，根據(jù)ProteoPrepBlueAlbumin&IgGDepletionKit(SIGMA)試劑盒和2-Dcleanupkit(AmershamBiosciences)試劑盒的說(shuō)明分別用于清除樣本中的白蛋白與球蛋白和鹽與脂。然后利

4、用牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用Bradford法測(cè)定濃度，下一步進(jìn)行雙向電泳。 2、雙向電泳主要按照G(o)rg等方法和Bio—Rad儀器操作手冊(cè)進(jìn)行。第一相等電聚焦(IEF)，血清的上樣量總體積為0.35ml，(含總蛋白質(zhì)0.3mg)。等電聚焦結(jié)束后，迅速取出IPG膠條，分別置于平衡液中各平衡15分鐘。預(yù)灌制好聚丙烯酰胺凝膠后，將平衡好的IPG膠條置于SDS膠面上，低熔點(diǎn)0.5％瓊脂糖封膠，設(shè)定電泳條件進(jìn)行垂直聚焦，直至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線(xiàn)停

5、止電泳。隨后對(duì)凝膠進(jìn)行硝酸銀銀染。 3、凝膠圖像分析凝膠通過(guò)ImageScannerⅡ透射掃描儀及Labscan掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像，利用ImageMaster2DElite5.0分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行強(qiáng)度效正、點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、匹配。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS15.0軟件上進(jìn)行。 4、MALDI—TOF—TOF—MS質(zhì)譜分析切取6個(gè)差異較明顯表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過(guò)膠內(nèi)酶切，點(diǎn)樣，應(yīng)用基質(zhì)輔助電離解析飛行時(shí)間質(zhì)譜MALD

6、I—TOF/TOF—MS鑒定蛋白質(zhì)，獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptidemassfingerprint，PMF)和二級(jí)質(zhì)譜圖。 5、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索利用軟件Mascotdistiller過(guò)濾基線(xiàn)峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.matrixscience.com)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢(xún)其功能，來(lái)明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。 6、酶

7、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)另外30例腰椎間盤(pán)突出患者和30例正常人及非椎間盤(pán)突出患者共30例利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定所得出蛋白的血清學(xué)水平。 結(jié)果： 1.建立了重復(fù)性好、分辨率高的LDH血清及正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜，LDH組和正常對(duì)照組各3塊凝膠間的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為(950±50)和(920±50)，其平均匹配百分率分別為85.8％和84.5％；同一樣本3塊不同膠之間在等電聚焦(Isoelectricfocusing，IEF)

8、方向的平均偏差為1.08±0.15mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)方向上的平均偏差為1.19±0.28mm。 2.比較分析10例LDH血清及正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析匹配，其平均匹配的點(diǎn)數(shù)為960個(gè)。篩選出在LDH血清和正常人血清差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共6個(gè)(表達(dá)量相差3倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為

9、兩組差異表達(dá)蛋白質(zhì))，其中3個(gè)蛋白點(diǎn)在LDH組中表達(dá)下調(diào)，2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)點(diǎn)在正常組組中不表達(dá)。 3.對(duì)6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI—TOF/TOF—MS的鑒定，共獲得4張蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，其中鑒定出一些與LDH發(fā)病機(jī)制可能相關(guān)的蛋白質(zhì)，分別為載脂蛋白L1(apolipoprotein—L1，ApoL1)、四連接素(Tetranectin，TN)、載脂蛋白M(apolipoproteinM，Ap

10、oM)和免疫球蛋白輕鏈(immunoglobulinlightchain，IGL)。 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)ApoL1、TN、ApoM和IGL的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示與雙向電泳的分析結(jié)果是一致的，確實(shí)為陽(yáng)性結(jié)果。 結(jié)論： 本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)LDH血清和正常人血清進(jìn)行研究，建立了重復(fù)性好、分辨率高的LDH血清和正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜，比較分析兩者蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，識(shí)別并鑒定出其中的差異蛋白