泛素連接酶Cbl家族蛋白在三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的： 三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)是治療以t(15；17)易位引起的PML/RARα融合蛋白為特征的急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)最有效的藥物之一。ATO以相對(duì)低濃度(≤2μM)即可降解PML/RARα融合蛋白并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATO對(duì)缺乏PML/RARα融合蛋白的許多腫瘤細(xì)胞均有抗癌活性，包括急性髓性白血病，淋巴細(xì)胞白血病，多發(fā)性骨髓瘤以及實(shí)體腫瘤等。然而，由于敏感性或耐藥性的不同嚴(yán)重阻礙了臨床應(yīng)用。

2、另外，ATO對(duì)大部分的實(shí)體腫瘤細(xì)胞雖然具有殺傷毒性但是敏感性差，而且大多伴隨細(xì)胞周期的改變，G1期阻滯或G2/M期阻滯。目前對(duì)ATO在APL和實(shí)體腫瘤中產(chǎn)生不同作用的機(jī)制尚不清楚。 Phosphatidylinositol3—kinase(PI3K)/Akt通路被認(rèn)為是重要的存活信號(hào)通路。在多種腫瘤中研究表明PI3K/Akt的失調(diào)控可能造成腫瘤形成，轉(zhuǎn)移和對(duì)化療耐藥。組成性的或誘導(dǎo)出的p—Akt介導(dǎo)重要底物分子的磷酸化，改變他

3、們的活性從而啟動(dòng)或抑制凋亡。同時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路也受到PTEN和Ras等信號(hào)分子的調(diào)節(jié)。 泛素連接酶Casitas B—lineage Lymphoma(Cbl)家族蛋白作為一種PI3K/Akt信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在一些細(xì)胞如T細(xì)胞、破骨細(xì)胞的功能中起著非常重要的作用[30-33]。Cbl蛋白能夠與PI3K的p85亞單位結(jié)合，導(dǎo)致PI3K的泛素化和降解[34，35]而改變信號(hào)的傳導(dǎo)。然而，Cbl蛋白是否通過(guò)調(diào)控PI3K/

4、Akt信號(hào)參與ATO抗癌作用機(jī)制還不清楚。 胃癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)第二位常見(jiàn)的惡性腫瘤。在我國(guó)，胃癌是腫瘤死亡的主要原因之一。晚期患者的預(yù)后較差，總體療效不理想。尋找新的合適的藥物或合理應(yīng)用已知藥物提高胃癌療效甚為重要。臨床實(shí)踐證明毒副作用輕、療效肯定的ATO成為最好的候選藥物之一。因此有必要深入研究ATO對(duì)APL和胃癌的抗癌作用機(jī)制，尤其有必要確定在APL和胃癌中產(chǎn)生差異的確切機(jī)制。 為深入研究ATO抗癌機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先

5、以急性白血病細(xì)胞系NB4和HL60為ATO誘導(dǎo)凋亡模型，研究PI3K/Akt信號(hào)通路及泛素連接酶Cbl家族蛋白在此過(guò)程中的作用。其次以人胃癌細(xì)胞系MGC803，BGC823及SGC7901為模型，研究ATO對(duì)胃癌細(xì)胞的毒性作用，并研究了PI3K/Akt信號(hào)通路以及Cbl蛋白在這一過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。最后，進(jìn)一步探討了ATO在NB4和MGC803細(xì)胞中產(chǎn)生不同作用結(jié)果的分子學(xué)機(jī)制。 材料與方法： 1、采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法和MTT

6、法測(cè)定細(xì)胞活力。 2、采用流式細(xì)胞儀通過(guò)PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期解析及凋亡判定。 3、采用Western blot檢測(cè)Akt、p—Akt、bcl—2、p53、和Cbl—b、c—Cbl蛋白的表達(dá)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、ATO抑制細(xì)胞增殖 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)ATO對(duì)NB4，HL60細(xì)胞活力的影響。A

7、TO以劑量依賴性方式抑制NB4和HL60細(xì)胞增殖。抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)24小時(shí)分別1.91μM和4.36μM。MTT法檢測(cè)ATO對(duì)MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞活力的影響。ATO以劑量依賴性方式抑制細(xì)胞增殖。抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(IC50)24小時(shí)分別23.4μM，25.43μM，27.13μM。提示胃癌細(xì)胞對(duì)ATO敏感性差。 2、ATO誘導(dǎo)NB4，HL60細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/

8、M期阻滯 流式細(xì)胞儀分析顯示ATO分別作用NB4，HL60細(xì)胞24小時(shí)后，以劑量依賴方式增加細(xì)胞凋亡，即亞二倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(細(xì)胞凋亡率)增加。ATO分別處理胃癌MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞24小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍然保持活力，圓而非帖壁的細(xì)胞較對(duì)照組多見(jiàn)。進(jìn)一步以流式細(xì)胞儀分析，ATO處理胃癌細(xì)胞顯示顯著的G2/M期阻滯，而亞二倍體細(xì)胞無(wú)顯著增加。提示ATO對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803，BGC823，S

9、GC7901的作用不同于ATO對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞。 3、ATO對(duì)Akt活性的影響 分別以ATO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯的代表性濃度作用細(xì)胞不同的時(shí)間后檢測(cè)磷酸化Akt(p—Akt)和Akt。Western blot解析結(jié)果顯示，對(duì)照組NB4和HL60細(xì)胞均表達(dá)一定水平的p—Akt。ATO處理4小時(shí)后，二種細(xì)胞中均p—Akt顯著增加，而后逐漸降至本底水平以下。而Akt水平在ATO作用前后沒(méi)有變化。對(duì)照組胃

10、癌細(xì)胞中均表達(dá)不同程度的p—Akt。在處理4小時(shí)后，也出現(xiàn)p—Akt短暫活化，隨后降至本底水平以下。用25μM LY294002預(yù)處理細(xì)胞抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)果顯示LY294002顯著提高了ATO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡百分比(NB4，HL60)。LY294002顯著降低了ATO誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的G2/M期阻滯，同時(shí)顯著提高了的細(xì)胞凋亡率(MGC803，BGC823，SGC7901)。進(jìn)一步分析LY294002對(duì)p—Akt的影響，一致地顯

11、示LY294002預(yù)處理的細(xì)胞中ATO誘導(dǎo)的p—Akt的短暫活化消失。提示ATO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯過(guò)程中，p—Akt短暫活化為ATO本身的藥物特性，并且在ATO抗癌作用中起著重要的調(diào)節(jié)作用。而p—Akt的最終失活是細(xì)胞走向死亡的重要原因。 4、ATO對(duì)Cbl蛋白表達(dá)的影響 據(jù)報(bào)道，Cbl為PI3K/Akt信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。本研究檢測(cè)了Cbl蛋白的表達(dá)及其功能。Western blot解析結(jié)果顯示，ATO顯

12、著增加了NB4，HL60細(xì)胞中Cbl—b和c—Cbl蛋白表達(dá)，從4小時(shí)開(kāi)始上升，至24小時(shí)達(dá)到平臺(tái)。ATO也顯著增加了胃癌細(xì)胞MGC803，BGC823，SGC7901細(xì)胞中Cbl—b和c—Cbl蛋白表達(dá)。Ps341能夠抑制Cbl蛋白功能。10nMPs341預(yù)處理4小時(shí)后洗去藥物，加入ATO分別處理白血病細(xì)胞和胃癌細(xì)胞。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示Ps341預(yù)處理可部分減少ATO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(NB4，HL60)，而增強(qiáng)ATO誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M

13、期阻滯(MGC803，BGC823，SGC7901)。提示Cbl具有重要的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步地，Western blot解析結(jié)果顯示Ps341預(yù)處理本身對(duì)細(xì)胞的p—Akt基礎(chǔ)表達(dá)水平?jīng)]有影響。但是，Ps341預(yù)處理顯著延長(zhǎng)了ATO誘導(dǎo)的PI3K/Akt的活化持續(xù)時(shí)間。提示Cbl抑制了ATO誘導(dǎo)的p—Akt過(guò)度活化。上調(diào)Cbl蛋白表達(dá)可能為ATO最終抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，繼而使細(xì)胞走向死亡的作用機(jī)制之一。 5、比較ATO誘導(dǎo)

14、NB4細(xì)胞凋亡和MGC803細(xì)胞G2/M期阻滯過(guò)程中，bcl—2蛋白的變化 為了研究ATO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯產(chǎn)生不同結(jié)果的分子學(xué)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分析了凋亡早期標(biāo)志物bcl—2蛋白。分別以1μM和10μM ATO處理NB4細(xì)胞和MGC803細(xì)胞。在NB4細(xì)胞中，bcl—2蛋白從4小時(shí)開(kāi)始下降，至24小時(shí)顯著低于本底水平。然而，在MGC803細(xì)胞中，卻沒(méi)有bcl—2蛋白的下降，至16小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)磷酸化bcl—2。這些結(jié)果提示M

15、GC803細(xì)胞至少在10μM作用24小時(shí)以內(nèi)沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡與未能下調(diào)bcl—2蛋白有關(guān)。在MGC803細(xì)胞中，bcl—2的磷酸化滯后于G2/M期阻滯的出現(xiàn)，提示bcl—2的磷酸化并不是導(dǎo)致G2/M期阻滯的關(guān)鍵性因子。 6、比較ATO誘導(dǎo)凋亡和G2/M期阻滯過(guò)程中，p53蛋白的變化 NB4細(xì)胞和MGC803細(xì)胞表達(dá)比較高水平的p53蛋白。10μM ATO處理MGC803細(xì)胞4小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)p53蛋白表達(dá)顯著下降。然而，1μM

16、 ATO處理NB4細(xì)胞后，p53蛋白卻沒(méi)有顯著的改變。PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002顯著增加ATO處理的MGC803細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)，輕度增加NB4細(xì)胞p53表達(dá)。提示雖然ATO誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡沒(méi)有p53的降解，但是短暫活化的PI3K/Akt信號(hào)在兩種細(xì)胞中均抑制了p53蛋白表達(dá)。Ps341預(yù)處理進(jìn)一步減少1ATO處理的胃癌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)，但是NB4細(xì)胞中p53卻沒(méi)有明顯變化。進(jìn)一步，在BGC823，SGC7

17、901細(xì)胞中也見(jiàn)到與MGC803細(xì)胞中相似現(xiàn)象。提示p53功能的最終狀態(tài)是使細(xì)胞發(fā)生凋亡還是G2/M期阻滯的關(guān)鍵因子。 結(jié)論： 1、ATO抑制急性白血病細(xì)胞和胃癌細(xì)胞增殖，但是胃癌細(xì)胞敏感性最差。 2、ATO誘導(dǎo)NB4，HL60細(xì)胞凋亡，胃癌細(xì)胞MGC803，BGC823，SGC7901則G2/M期阻滯 3、ATO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯過(guò)程中均伴隨短暫活化PI3K/Akt信號(hào)。 4、ATO誘