黃芩莖葉總黃酮對(duì)Aβ致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又稱老年性癡呆,是引起癡呆的重要疾病來源,隨著進(jìn)入老齡化社會(huì),AD給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。自1906年Alois Alzheimer首次命名并報(bào)道AD以來,人們一直在尋找其發(fā)病機(jī)制及預(yù)防和治療措施。盡管AD發(fā)病機(jī)制目前還不十分明確,但淀粉樣蛋白(amyloid protein,Aβ)作為AD發(fā)病的始動(dòng)因子已基本得到認(rèn)可。Ap25-35是Aβ的功能性片段,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示

2、了Aβ25-35能引起大鼠海馬經(jīng)元損傷、學(xué)習(xí)、記憶能力下降。臨床藥物對(duì)老年性癡呆的治療效果不佳,主要以增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能藥物為主,國外開發(fā)抗AD藥物主要集中在通過研究AD發(fā)病的分子機(jī)制尋找新的靶點(diǎn)及抗氧化植物藥,國內(nèi)主要圍繞抗氧化植物藥進(jìn)行開發(fā)。黃酮類化合物是自然界分布較廣泛的一類次生代謝產(chǎn)物,是植物藥抗氧化的一個(gè)重要有效成分。黃芩是我國傳統(tǒng)的中草藥,對(duì)黃芩的研究集中在其有效成分黃酮類化合物,研究表明黃芩莖葉總黃酮具有抗炎、抗免疫、保護(hù)

3、心肌缺血再灌注損傷、減輕腦缺血引起的損傷等作用。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射淀粉樣蛋白(Aβ25-35)制備大鼠癡呆模型,從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡等機(jī)制觀察黃芩莖葉總黃酮(Scutellaria Baicalensis Stem-leaf TotalFlavonoid,SSTF)對(duì)Aβ致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力損傷的影響及機(jī)制,以期為抗氧化植物藥用于AD的預(yù)防、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分黃芩莖葉總黃酮對(duì)Aβ致大鼠學(xué)習(xí)記

4、憶損傷的影響
　　 目的:觀察SSTF對(duì)大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力損傷的影響。
　　 方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)分組及處理:雄性Wistar大鼠100只,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、SSTF低、中、高劑量組、VE組,每組16只,對(duì)照組、模型組灌胃蒸餾水,其它各組分別灌胃SSTF(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)、VE(10mg/只),灌胃20天,在灌胃一周后對(duì)照組大鼠海馬注射生理鹽水,其它各

5、組注射Aβ,注射Aβ一周后做Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),連續(xù)做6天后處死。選4只大鼠注射Aβ3天后處死,腦組織外固定后30μm厚連續(xù)震蕩切片,觀察針道。
　　 2模型制備:采用腦立體定位技術(shù),于大鼠AP-3.5mm,ML±2mm,DV2.7mm定位海馬CA1區(qū),注射凝膠態(tài)Aβ5μl含10μg。
　　 3.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):于大鼠海馬注射Aβ一周后做水迷宮實(shí)驗(yàn),每天2次,連續(xù)6天,記錄大鼠60秒內(nèi)尋找平臺(tái)的潛伏期,第6天

6、測(cè)定大鼠尋找平臺(tái)潛伏期后撤去平臺(tái),觀察大鼠2分鐘內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù),2分鐘內(nèi)在平臺(tái)區(qū)象限停留的時(shí)間,2分鐘內(nèi)大鼠在平臺(tái)區(qū)象限所游路程與總路程比值。
　　 4標(biāo)本處理:每組取3只大鼠行多聚甲醛灌注進(jìn)行內(nèi)固定,取大鼠腦組織進(jìn)行外固定,石蠟包埋,做HE、硫堇尼氏體染色。剛果紅染色確認(rèn)Aβ注射部位,每組取2只大鼠腦組織做電鏡標(biāo)本。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)論:
　　

7、1大鼠海馬注射Aβ可明顯降低血清中SOD、GSH-Px、CAT酶的活力,降低大鼠海馬、皮層組織中SOD、GSH-Px酶的活力,導(dǎo)致血清、海馬及皮層中抗氧化能力降低,氧化產(chǎn)物增多,引起大鼠海馬及皮層神經(jīng)元損傷。SSTF可明顯減輕Aβ引起的大鼠血清、海馬及皮層中抗氧化酶活力降低,減少氧化產(chǎn)物合成,減輕神經(jīng)元損傷,具有神經(jīng)元保護(hù)作用,且有一定的劑量依賴性。
　　 2大鼠海馬注射Aβ可引起大鼠血清中TNF-α,IL-1β合成增多,SST

8、F對(duì)TNF-α,IL-1β合成無明顯影響。
　　 第三部分 SSTF對(duì)抗Aβ致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的抗凋亡機(jī)制研究
　　 目的:分析SSTF對(duì)抗Aβ致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷作用與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 2免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬、皮層組織中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表達(dá),測(cè)定切片著色細(xì)胞的光密度值。
　　 3 western

9、 blotting檢測(cè)大鼠海馬組織中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表達(dá),測(cè)定各指標(biāo)與β-actin的灰度比值。
　　 結(jié)果:
　　 1 TUNEL檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)及皮層神經(jīng)元凋亡:TUNEL檢測(cè)顯示,大鼠海馬CA1區(qū)及皮層凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞核著棕黃色,模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮層著色細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組多,著色深,SSTF中、高劑量組較模型組著色細(xì)胞數(shù)少,著色淺。
　　 對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)及皮

10、層IOD分別為7.77,1.34,模型組IOD(40.41,27.73)明顯高于對(duì)照組;SSTF中、高劑量組較模型組明顯降低,SSTF中、高劑量組間有明顯差別。
　　 2免疫組化結(jié)果:
　　 2.1 bax在大鼠海馬及皮層神經(jīng)元胞漿中呈棕黃色顆粒,模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮層中著色細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組多,著色深,SSTF中、高劑量組著色細(xì)胞數(shù)較模型組少,著色淺。
　　 大鼠海馬及皮層組織中Bax免疫組化IOD:對(duì)照組大

11、鼠海馬CA1區(qū)及皮層IOD分別為20.78,13.43,模型組IOD(144.51,57.83)明顯高于對(duì)照組;SSTF中、高劑量組明顯低于模型組;且中、高劑量組間有明顯差別。
　　 2.2 Bcl-2在大鼠海馬及皮層神經(jīng)元胞漿中呈棕黃色,模型組海馬CA1區(qū)、皮層組織中著色細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組少,著色淺,SSTF中、高劑量組較模型組著色細(xì)胞多,著色深。
　　 大鼠海馬CA1區(qū)及皮層組織中Bcl-2免疫組化IOD:對(duì)照組大鼠海馬

12、CA1區(qū)及皮層IOD分別為115.24,31.56,模型組IOD(21.45,2.67)明顯低于對(duì)照組:SSTF中、高劑量組的IOD明顯高于模型組。
　　 2.3 Caspase-3在大鼠海馬、皮層神經(jīng)元胞漿、胞核中均有表達(dá),模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮層組織著色細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組多,著色深,SSTF中、高劑量組較模型組著色細(xì)胞少,著色淺。
　　 大鼠海馬CA1區(qū)及皮層組織中Caspase-3免疫組化IOD:對(duì)照組大鼠海馬CA

13、1區(qū)及皮層IOD分別為22.47,3.27,模型組IOD(126.28,18.45)明顯高于對(duì)照組;SSTF中、高劑量組IOD明顯低于模型組。
　　 2.4 cyt-c多在大鼠海馬及皮層神經(jīng)元胞漿中表達(dá),呈棕黃色,偶爾也在胞核表達(dá),模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮層著色細(xì)胞較對(duì)照組多,著色深,SSTF中、高劑量組較模型組著色細(xì)胞少,著色淺。
　　 大鼠海馬CA1區(qū)及皮層組織中cyt-c免疫組化IOD:對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)及皮

14、層中IOD分別為25.13,2.86,模型組.IOD(124.79,16.57)明顯高于對(duì)照組;SSTF中、高劑量組較模型組明顯降低。
　　 3 western blotting:
　　 對(duì)照組大鼠海馬組織中bax/β-actin、caspase-3/β-actin、cyt-c/β-actin分別為0.1027,0.0388,0.6053,模型組(0.2678,0.1660,1.2491)明顯高于對(duì)照組:SSTF中、高劑

15、量組明顯低于模型組。
　　 對(duì)照組大鼠海馬組織中bcl-2/β-actin為0.4131,模型組(0.2354)明顯低于對(duì)照組;SSTF高劑量組(0.2964)明顯高于模型組。
　　 結(jié)論:大鼠海馬注射Aβ使促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表達(dá)上調(diào),bcl-2表達(dá)下調(diào),引起海馬、皮層組織中神經(jīng)元凋亡,SSTF能下調(diào)促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表達(dá),上調(diào)bcl-2表達(dá),減輕Aβ引起的的神

16、經(jīng)元凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1大鼠海馬注射Aβ引起大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力下降與Aβ引起抗氧化酶活力降低,氧化產(chǎn)物合成增多,引起神經(jīng)元損傷有關(guān);其次與Aβ引起促炎癥因子TNF-α,IL-1β釋放,導(dǎo)致其它炎癥因子釋放有關(guān);氧化產(chǎn)物的增多、炎癥因子的釋放可刺激促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表達(dá),抑制抗凋亡基因bcl-2表達(dá),進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷。
　　 2黃芩莖葉總黃酮能減輕Aβ引起的大鼠學(xué)習(xí)、記憶