黃淮海地區(qū)重組型大豆花葉病毒的侵染性與生物學(xué)特性分析.pdf

1、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)病是一種世界性的病毒性病害，在各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和商品價(jià)值。病毒的變異、重組是新病毒產(chǎn)生、寄主范圍改變以及致病性變化的重要原因。了解病毒信息，明確病毒的致病性，對(duì)防控病毒的大面積流行有著重要的作用。重組型SMV是2011年Yang等從重慶大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種新型SMV病毒類(lèi)型，目前對(duì)于這種新型SMV類(lèi)型的系統(tǒng)性研究還未開(kāi)展，新型SMV的出現(xiàn)也使大豆病害防治

2、和抗病育種工作面臨新的挑戰(zhàn)。本研究目的是在發(fā)現(xiàn)重組型SMV的基礎(chǔ)上調(diào)查黃淮海地區(qū)SMV的組成情況，通過(guò)分離純化獲得重組型SMV分離物，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，分析其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類(lèi)和地位;選取一些國(guó)內(nèi)外的大豆品種，利用重組型SMV進(jìn)行抗性鑒定，分析其致病性和侵染力與非重組型SMV差異;構(gòu)建感染重組型SMV的模式作物的酵母雙雜文庫(kù)，奠定深入研究重組型SMV侵染機(jī)制的物質(zhì)平臺(tái)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)從黃淮海地區(qū)共采集357

3、份病樣，利用DSA-ELISA和RT-PCR兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示162份病樣呈SMV陽(yáng)性，檢出率為45.4％。其中，83份病樣僅檢測(cè)出非重組型SMV，7份病樣僅檢測(cè)出重組型SMV，其余72份病樣均檢測(cè)出兩種類(lèi)型SMV。此外，重組型SMV在河北省、安徽省及北京市的大豆產(chǎn)區(qū)均有分布。在162個(gè)SMV樣品中，含非重組型SMV的病樣占比95.6％，含重組型SMV的病樣占比48.7％;結(jié)果表明黃淮海SMV病害仍以非重組型SMV為主，但重組型

4、SMV也廣泛分布，需要進(jìn)一步關(guān)注。
　　(2)利用菜豆品種Top-Crop采用枯斑分離的方式獲得了一個(gè)來(lái)源于河北省的重組型SMV分離物HB-RS。利用RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果顯示，HB-RS除poly-A尾巴外，由9993個(gè)核苷酸組成，翻譯后形成3202個(gè)氨基酸，比非重組型SMV分離物Sc6多出135個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，除重組類(lèi)型SMV外，HB-RS與Sc6親緣關(guān)系最近。其中，HB-RS的5'UTR

5、與P1的2/3N端與BCMV同源性最高，其余均與SMV同源性最高。研究結(jié)果表明，HB-RS仍屬于SMV一種，是由BCMV和SMV在P1編碼區(qū)重組而來(lái)。
　　(3)選取15份以往抗性鑒定中表現(xiàn)較好的大豆品種，利用人工接種的方法鑒定對(duì)HB-RS抗性表現(xiàn)，結(jié)果顯示對(duì)HB-RS表現(xiàn)免疫、中抗和感病的材料分別有5份，1份和8份。進(jìn)一步選取其中4個(gè)抗感層次不同的品種進(jìn)行接種Sc6后對(duì)比分析，并利用qRT-PCR方法對(duì)兩種類(lèi)型的SMV在大豆葉片

6、中的濃度積累進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，癥狀上Sc6侵染寄主后容易形成壞死斑，HB-RS則主要以輕花葉為主;但HB-RS在4個(gè)大豆品種中病毒積累濃度卻顯著高于Sc6，結(jié)果表明HB-RS對(duì)大豆更具有侵染性，但致病力較Sc6弱。
　　(4)以可系統(tǒng)侵染本氏煙的重組型SMV分離物HB-RS為毒源，構(gòu)建感染HB-RS本氏煙的酵母雙雜cDNA文庫(kù)。利用SMART技術(shù)獲得本氏煙的雙鏈cDNA文庫(kù)，通過(guò)雙酶切手段將cDNA文庫(kù)構(gòu)建至pGADT7-Sfi

7、I載體上。檢測(cè)結(jié)果顯示，文庫(kù)容量約為3.2×106 cfu，插入cDNA片段長(zhǎng)度在0.75～2Kb之間，平均長(zhǎng)度大于1kb，且多態(tài)性豐富，表明文庫(kù)質(zhì)量較好。
　　以上研究結(jié)果表明:重組型SMV在黃淮海地區(qū)分布普遍，在北京、安徽、河北各省市均有發(fā)現(xiàn)。且重組型SMV與非重組型SMV基因組結(jié)構(gòu)基本一致，但重組型SMV的P1端是由SMV和BCMV在P1編碼區(qū)重組而來(lái)的。重組型SMV與非重組型SMV中的SC6親緣關(guān)系最近，兩者的致病性和侵染