代謝活化系統(tǒng)在人細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中的應(yīng)用.pdf

1、隨著人類社會(huì)的發(fā)展，越來(lái)越多的化學(xué)致癌物進(jìn)入人們的生活，目前致癌物的檢測(cè)方法存在很多不足，促使人們尋找更加敏感、特異、快速的檢測(cè)方法。細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)作為一種化學(xué)致癌物檢測(cè)模型越來(lái)越受到人們的重視。 通過(guò)人為改變?nèi)嗽?xì)胞中一些癌基因或抑癌基因的表達(dá)，能使其逃脫老化而獲得永生化。盡管這些永生化細(xì)胞獲得了無(wú)限增殖的能力，但沒(méi)有獲得惡性細(xì)胞的表型，在永生化的細(xì)胞中繼續(xù)導(dǎo)入其他的癌基因，最終使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化前的階段，細(xì)胞并沒(méi)有惡

2、性表型，而是處于逐漸發(fā)牛轉(zhuǎn)化的易感狀態(tài)，處于此階段的細(xì)胞在致癌因素作用下比正常的永生化細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，我們選取處于轉(zhuǎn)化前期易感階段的細(xì)胞作為模型，來(lái)檢測(cè)致癌物的致癌活性。 本課題組已經(jīng)證實(shí)，處于易感狀態(tài)的細(xì)胞(高表達(dá)H-RasV12和c-Myc的永生化呼吸道上皮細(xì)胞)對(duì)直接致癌物的敏感性比正常細(xì)胞高。說(shuō)明此細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型對(duì)于直接致癌物的檢測(cè)有很高的靈敏度。而環(huán)境中除了直接致癌物外，絕大部分是間接致癌物，必須經(jīng)過(guò)代謝活化才

3、具有致癌活性。所以細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中必須包括一個(gè)代謝系統(tǒng)來(lái)活化間接致癌物。目前，在致癌活性檢測(cè)中，S9雖然是經(jīng)典的代謝系統(tǒng)，但存在很多不足。與S9相比，細(xì)胞內(nèi)的活化系統(tǒng)代謝能力更強(qiáng)，彌補(bǔ)了S9的很多不足。細(xì)胞內(nèi)代謝包括在細(xì)胞中高表達(dá)特異性代謝酶和誘導(dǎo)特異性代謝酶的表達(dá)。 我們選擇永生化人肝細(xì)胞，導(dǎo)入第12密碼子突變的H-Ras癌基因，使其處于惡性轉(zhuǎn)化前的易感狀態(tài)。采用三種代謝系統(tǒng)：高表達(dá)CYP1A2，底物誘導(dǎo)CYP1A2的高表達(dá)和S

4、9，選擇具有代表性的間接致癌物黃曲霉毒素B1(Aflotoxin B1，AFB1)作用于永生化和轉(zhuǎn)化前期細(xì)胞株，通過(guò)軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)和裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)驗(yàn)證在代謝系統(tǒng)的活化下，間接致癌物誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，探討活化系統(tǒng)在人細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中應(yīng)用的可行性，為間接化學(xué)誘變物和致癌物的檢測(cè)提供穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異度好和更接近人體的活化系統(tǒng)。 研究方法： 1.1 RAS高表達(dá)細(xì)胞株L02-R和ST高表達(dá)細(xì)胞株L02-RST

5、的建立利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的方法在人永生化肝細(xì)胞L02的基礎(chǔ)上構(gòu)建癌基因H-RasV12(V12，第12密碼子突變)高表達(dá)的細(xì)胞株L02-R，免疫印跡檢測(cè)RAS蛋白的表達(dá)。為了提供與L02-R基因背景接近的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞，L02-R中導(dǎo)入SV-40的小T抗原(SV 40 small antigen，ST)。通過(guò)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)檢測(cè)ST的蛋白表達(dá)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、繪制生長(zhǎng)曲線

6、以及惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)觀察所構(gòu)建細(xì)胞株的生物學(xué)特性。 1.2.三種代謝系統(tǒng)的建立和評(píng)價(jià) 1.2.1 S9代謝活化系統(tǒng)的制備和檢測(cè)多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)誘導(dǎo)大鼠，常規(guī)方法制備S9，BCA法測(cè)定S9的蛋白含量，Ames試驗(yàn)測(cè)定S9的代謝活性。 1.2.2高表達(dá)CYP1A2細(xì)胞株的建立用BamHI和XhoI酶切pCR2.1-ToPo-CYP1A2，得到CYP1A2，連接到逆轉(zhuǎn)

7、錄病毒載體pMIG上，獲得pMIG-CYP1A2質(zhì)粒。用逆轉(zhuǎn)錄病毒pMIG-CYP1A2表達(dá)載體在L02-R的基礎(chǔ)上建立高表達(dá)CYP1A2的細(xì)胞株L02-RA。免疫印跡測(cè)定CYP1A2蛋白的表達(dá)，P450-GLOTM試劑盒測(cè)定CYP1A2的酶活性。 1.2.3 AFB1對(duì)L02細(xì)胞中CYP1A2的誘導(dǎo)效應(yīng)用0.1μM AFB1誘導(dǎo)48小時(shí)后換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)維持培養(yǎng)到96小時(shí)，分別在誘導(dǎo)的24、48、72和96小時(shí)測(cè)定CYP1A

8、2的表達(dá)，來(lái)確定誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)。用免疫印跡測(cè)定CYP1A2的表達(dá)，P450-GLOTM試劑盒測(cè)定CYP1A2的酶活性。 1.3AFB1誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1.3.1 AFB1染毒濃度的確定： 在相同的染毒濃度下，測(cè)定三種代謝系統(tǒng)活化AFB1所引起的細(xì)胞毒性。選擇其中毒性最大的IC50的50％、20％和5％作為染毒劑量。 1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)每周染毒一次，連續(xù)染毒四次。染毒后第5周開始每隔兩周做一次軟

9、瓊脂試驗(yàn)，直至陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)；連續(xù)兩次軟瓊脂試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果后進(jìn)行裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)。 結(jié)果： 2.1 RAS和ST高表達(dá)細(xì)胞株的建立免疫印跡檢測(cè)RAS蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示L02-R的RAS表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞升高約5倍。L02-RST熒光蛋白的表達(dá)效率較高，達(dá)到80％。與L02相比，L02-R和L02-V在形態(tài)上沒(méi)有明顯改變。L02-RST細(xì)胞體積變大，失去了原來(lái)的多角形形態(tài)，出現(xiàn)局部重疊生長(zhǎng)的現(xiàn)象，提示細(xì)胞已經(jīng)失去正常的接觸抑制

10、，出現(xiàn)惡性表型。L02-V和L02-R的生長(zhǎng)速度比較接近，L02-RST的生長(zhǎng)速度最快。軟瓊脂試驗(yàn)結(jié)果顯示，L02-V、L02-R偶見克隆形成；而L02-RST形成較多克隆。裸鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示L02、L02-V和L02-R在接種后3個(gè)月內(nèi)均未能在裸鼠皮下形成腫瘤；而L02-RST則在接種后第10天長(zhǎng)出肉眼可見的腫瘤。 2.2三種代謝系統(tǒng)的建立和評(píng)價(jià) 2.2.1 S9代謝系統(tǒng)的建立Ames試驗(yàn)檢測(cè)S9的活性的結(jié)果說(shuō)明S9能夠

11、代謝間接致癌物。 2.2.2高表達(dá)CYP1A2細(xì)胞株的建立免疫印跡測(cè)定結(jié)果顯示L02-RA中CYP1A2的表達(dá)結(jié)果比對(duì)照升高約5倍。酶活性的測(cè)定結(jié)果與免疫印跡的結(jié)果一致。與對(duì)照細(xì)胞相比，L02-RA和L02-VA在形態(tài)學(xué)上未見明顯改變，CYP1A2的導(dǎo)入并未影響細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)。L02-RA和L02-R細(xì)胞的倍增時(shí)間分別是33.53小時(shí)和34.85小時(shí)，提示CYP1A2導(dǎo)入對(duì)L02R細(xì)胞的生長(zhǎng)速度影響不大。L02-VA、L02-R

12、A的軟瓊脂實(shí)驗(yàn)和裸鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。 2.2.3 AFB1誘導(dǎo)L02細(xì)胞CYPIA2的高表達(dá)免疫印跡測(cè)定AFB1誘導(dǎo)L02細(xì)胞CYP1A2的高表達(dá)，結(jié)果顯示CYP1A2蛋白的表達(dá)于誘導(dǎo)48小時(shí)達(dá)到高峰，當(dāng)撤掉AFB1后，CYP1A2蛋白的表達(dá)開始下降，但于72和96小時(shí)仍可觀察到明顯的CYPlA2表達(dá)。酶活性測(cè)定的結(jié)果顯示，AFB1能夠誘導(dǎo)CYP1A2的表達(dá)，并且有劑量反應(yīng)關(guān)系。 2.3.AFB1誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

13、 2.3.1染毒濃度的確定S9活化AFB1后，引起的細(xì)胞毒性最強(qiáng)。根據(jù)抑制率和濃度的回歸方程計(jì)算S9活化AFB1的IC50是0.64μM，不加活化系統(tǒng)時(shí)，AFB1的IC50是5.24μM。根據(jù)有S9活化時(shí)AFB1的半數(shù)抑制濃度IC50確定三種活化系統(tǒng)的染毒濃度為0.3μM、0.1μM和0.03μM。 2.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)： (1)AFB1經(jīng)三種代謝系統(tǒng)活化后均可誘導(dǎo)高表達(dá)RasV12的細(xì)胞株在不同的時(shí)間發(fā)生轉(zhuǎn)化，在

14、染毒20周內(nèi)均未能誘導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞L02-V發(fā)生轉(zhuǎn)化。 (2)未加代謝系統(tǒng)的條件下，經(jīng)AFB1染毒的L02-R在第17周發(fā)生轉(zhuǎn)化：而加入S9時(shí)，在第8周發(fā)生轉(zhuǎn)化，比L02-R縮短了9周；經(jīng)0.1μMAFB1誘導(dǎo)和高表達(dá)CYP1A2均使轉(zhuǎn)化問(wèn)期縮短6周，于第11周發(fā)生轉(zhuǎn)化。 (3)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng)與AFB1有劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了癌基因H-RasV12和P450 CYP1A2穩(wěn)定高表達(dá)的轉(zhuǎn)基

15、因細(xì)胞株。所構(gòu)建的細(xì)胞株在生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)速度、錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)等生物學(xué)特性未發(fā)生明顯改變，沒(méi)有獲得惡性轉(zhuǎn)化的表型。在高表達(dá)H-Ras的基礎(chǔ)上繼續(xù)導(dǎo)入SV40 ST能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 2.三種代謝系統(tǒng)：大鼠肝微粒體組份S9、AFB1低劑量誘導(dǎo)和細(xì)胞高表達(dá)CYP1A2都能夠促進(jìn)間接致癌物AFB1的代謝活化，縮短細(xì)胞轉(zhuǎn)化的時(shí)間，提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率。 3.從試驗(yàn)操作難度、試驗(yàn)的重復(fù)性、試驗(yàn)結(jié)果的可靠性等幾個(gè)方面比較三種代謝系統(tǒng)