表皮細胞培養(yǎng)中維持干細胞特性相關(guān)技術(shù)的研究.pdf

1、目的：（1）利用流式細胞儀檢測表皮細胞整合素β1亞基（CD29）和增殖細胞核抗原（PCNA）的熒光標記強度,建立簡便易行的表皮干細胞檢測方法.（2）利用該檢測手段,通過優(yōu)化表皮細胞分離、培養(yǎng)條件,以提高培養(yǎng)表皮細胞中的干細胞數(shù)量.（3）構(gòu)建人整合素β1基因重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染表皮細胞,觀察其生物學特征的改變,為進一步皮膚組織工程研究提供理論基礎(chǔ)和研究手段.方法：（1）分離表皮細胞,通過粘附選擇富集表皮干細胞和短暫擴充細胞,觀察細胞克隆形

2、成率,流式細胞儀檢測表皮細胞CD29和PCNA、熒光免疫組織化學檢測BrdU的熒光標記強度,分析上述指標間的相關(guān)性.（2）利用L16（4<'4>）正交表設(shè)計試驗,選擇原代培養(yǎng)消化過程中DispaseⅡ酶與胰蛋白酶不同濃度和作用時間,以及無血清培養(yǎng)基中EGF、胰島素、霍亂毒素、氫化考的松的不同濃度為實驗因素,考察表皮細胞生物學性狀和其中CD29<'+>/PCAN<'->細胞的比例,優(yōu)化最佳分離和培養(yǎng)條件.（3）利用AdeasyTM系統(tǒng)構(gòu)建

3、含ITG-β1基因片段的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染人原代培養(yǎng)表皮細胞,觀察細胞克隆形成率和CD29<'+>/PCAN<'->細胞的比例.結(jié)論：（1）CD29<'+>/PCAN<'->細胞比例與鑒定干細胞的基本指標BrdU陽性率及細胞周期均具有良好的相關(guān)性,可以作為表皮干細胞的檢測指標.（2）對于原代表皮細胞分離培養(yǎng),0.125﹪ DispaseⅡ酶冷消化10h,0.1﹪胰蛋白酶37℃消化30min,培養(yǎng)體系中EGF、胰島素、霍亂毒素、氫化考的