載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料治療兔脛骨慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性骨髓炎的治療基本原則之一就是在充分的抗菌素治療基礎(chǔ)上徹底清除病灶。而病灶清除，死骨摘除后常出現(xiàn)不同范圍的骨缺損，如骨缺損大，影響了骨干的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，則常需要植骨以促進(jìn)骨愈合。盡管采用了徹底的清創(chuàng)方法，但缺損部位仍有一定數(shù)量的細(xì)菌殘留，當(dāng)有外來(lái)植入物時(shí)，這些細(xì)菌易大量繁殖，常導(dǎo)致治療失敗。因此，良好的骨填充材料必須既能填充骨缺損又能殺滅殘留致病菌。自1980年Klemm應(yīng)用抗生素骨水泥防治骨組織感染成功后，抗生素的局部應(yīng)用越來(lái)越

2、引起人們的重視。局部藥物緩釋系統(tǒng)可以直接作用于病變部位，不需血液將藥物抗生素?cái)y帶至病變區(qū)域，可在局部獲得持續(xù)的較高藥物濃度，同時(shí)保持較低的血藥濃度，避免全身系統(tǒng)用藥的毒副作用。抗生素骨水泥雖然在治療慢性骨髓炎臨床應(yīng)用中取得了極大的成功，但其仍有許多不足：（1）由于骨水泥結(jié)合時(shí)有一個(gè)放熱過(guò)程，溫度較高，只可應(yīng)用于耐高溫的有限劑量的抗生素；（2）由于受抗菌譜的影響，加之近年來(lái)耐藥菌株的增多使其臨床應(yīng)用受到了不同程度的限制；（3）部分抗生素的

3、種類及濃度影響局部骨的生長(zhǎng)，局部高的抗生素濃度對(duì)成骨樣細(xì)胞的增殖有影響。（4）感染控制需再次手術(shù)取出珠鏈；（5）骨水泥無(wú)成骨作用，不能對(duì)骨缺損進(jìn)行修復(fù)。納米羥基磷灰石/聚酰胺66（n-HA/PA66）復(fù)合生物活性人工骨是由我們與四川大學(xué)聯(lián)合開(kāi)發(fā)出的一種新型納米仿生復(fù)合骨修復(fù)替代材料，前期研究顯示該材料的生物相容性好，機(jī)械性能佳，是一種良好的骨替代材料。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上成功開(kāi)發(fā)出二氧化鈦載銀納米羥基磷灰石/聚酰胺66抗菌復(fù)合骨填充材料，本課

4、題研究其體外抗菌特性，細(xì)胞毒性，體外Ag+釋放特性及體外對(duì)MG63成骨樣細(xì)胞增殖的影響并探討其作為骨填充材料填充骨髓炎術(shù)后骨缺損的可行性及該材料在兔體內(nèi)的毒副作用，以期為該材料治療臨床慢性骨髓炎術(shù)后骨缺損提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 對(duì)二氧化鈦載銀納米羥基磷灰石/聚酰胺66抗菌復(fù)合骨填充材料體外抗菌特性，細(xì)胞毒性，體外Ag+釋放特性及對(duì)MG63成骨樣細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究，建立兔脛骨近端慢性骨髓炎動(dòng)物模型，并在兔脛

5、骨近端慢性骨髓炎動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，研究其作為骨填充材料治療骨髓炎術(shù)后骨缺損的治療效果，并研究該材料在兔體內(nèi)的毒副作用，期望找到一種既具有良好的局部抗感染能力又具有成骨能力的骨填充材料，為慢性骨髓炎的治療提供一種新型的局部抗菌劑緩釋系統(tǒng)，并為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)由四部分組成
　　 1、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料體外抗菌及釋放特性測(cè)定
　　 采用抑菌環(huán)試驗(yàn)、菌落數(shù)試驗(yàn)及掃描電鏡檢測(cè)載銀納

6、米抗菌復(fù)合骨填充材料對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能及抗粘附效果；采用原子吸收光譜法檢測(cè)載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料在模擬體液中釋放銀離子特性；通過(guò)MTT法，急性溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該材料的生物相容性。
　　 2、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料對(duì)成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 以納米羥基磷灰石/聚酰胺66為對(duì)照，采用相差顯微鏡、掃描電鏡、MTT、堿性磷酸酶ALP檢測(cè)、鈣含量測(cè)定等方法從MG63成骨樣細(xì)胞形態(tài)、增殖及生理功能等方面檢測(cè)載

7、銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料對(duì)MG63成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 3、兔脛骨慢性骨髓炎動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)
　　 采用脛骨近段髓腔注射5％魚肝油酸鈉和不同濃度的金黃色葡萄球菌菌液的方法誘導(dǎo)骨髓炎，并探討誘導(dǎo)的骨髓炎模型與菌液濃度的關(guān)系，為慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究提供一種合適的動(dòng)物模型。
　　 4、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料治療兔脛骨近段慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究及兔體內(nèi)毒副作用研究
　　 在慢性骨髓炎造模的基礎(chǔ)上，常

8、規(guī)病灶清除，分別植入載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料，載萬(wàn)古霉素骨水泥填充材料，nHA/PA66復(fù)合骨填充材料及空白對(duì)照組，通過(guò)大體標(biāo)本觀察、放射學(xué)、細(xì)菌學(xué)和組織學(xué)方法，觀察材料局部抗菌效果；通過(guò)放射學(xué)觀察，組織學(xué)檢查和鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記觀察材料成骨能力；并通過(guò)檢測(cè)肝臟、腎臟功能及各臟器中銀離子濃度，了解材料在兔體內(nèi)的毒副作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料體外抗菌及釋放特性測(cè)定
　　 載銀納米抗菌

9、復(fù)合骨填充材料體外對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌有明顯抗菌作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌，且抗菌能力隨銀離子含量的增加而加強(qiáng)；該材料在模擬體液中有良好的緩釋效果，對(duì)L929細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)紅細(xì)胞不產(chǎn)生毒性或機(jī)械損傷，具有良好的生物相容性。
　　 2、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料對(duì)MG63成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 MG63成骨樣細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的倒置相差顯微鏡可見(jiàn)MG63成骨樣細(xì)胞在材料周圍生長(zhǎng)情況良好，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在材料

10、周圍的細(xì)胞數(shù)量明顯增多；掃描電鏡顯示MG63成骨樣細(xì)胞在復(fù)合材料上生長(zhǎng)5天后可見(jiàn)細(xì)胞在復(fù)合材料上生長(zhǎng)狀況良好；MTT法結(jié)果顯示各組細(xì)胞的數(shù)目都隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，第七天時(shí)抗菌材料組的MTT值與對(duì)照組間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）；MG63成骨樣細(xì)胞在不同材料上培養(yǎng)和空白對(duì)照組的ALP活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，各材料組和對(duì)照組在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的ALP活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異（P>0.05）；細(xì)胞鈣離子含量測(cè)定顯示各組MG63成骨樣

11、細(xì)胞鈣離子含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。
　　 3、兔脛骨慢性骨髓炎動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)
　　 G0（注入0.1ml生理鹽水）、G1（注入0.1m13×107 CFU/ml細(xì)菌）、G2（注入0.1ml3×108 CFU/ml細(xì)菌）、G3（注入0.1ml3×109 CFU/ml細(xì)菌）、G4（注入0.3ml3×109 CFU/ml細(xì)菌）、G5（注入0.3ml6×109 CFU/ml細(xì)菌）各組造模后4周，影像學(xué)顯示均出現(xiàn)不同程度

12、的軟組織腫脹，骨密度降低，骨小梁纖細(xì)，數(shù)目減少，骨小梁間隙加寬，骨皮質(zhì)變薄，骨溶解，死骨形成；組織學(xué)切片顯示均出現(xiàn)不同程度的中性嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，骨髓腔內(nèi)髓細(xì)胞不同程度壞死，間質(zhì)出血；采用兔金黃色葡萄球菌骨髓炎模型嚴(yán)重程度分級(jí)大體標(biāo)本觀察和放射學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所誘導(dǎo)模型進(jìn)行嚴(yán)重程度分級(jí)：G1組屬0級(jí)，G2組屬1～2級(jí)，G3組屬2～3級(jí)，G4組屬3～4級(jí)，G5組屬4級(jí)。
　　 4、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料治療兔脛骨近段慢性骨髓炎的實(shí)

13、驗(yàn)研究及兔體內(nèi)毒副作用研究
　　 4.1載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料治療兔脛骨近段慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究
　　 抗菌效果：術(shù)后12周對(duì)各組Norden改良骨髓炎分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：A組（載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料）、B組（載萬(wàn)古霉素骨水泥填充材料）分別與C組（nHA/A66復(fù)合骨填充材料）、D組（空白組）比較，差異有非常顯著性（P<0.01），A、B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C、D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

14、>0.05）；術(shù)后12周，大體標(biāo)本可見(jiàn)A、B組保持較正常外觀形狀，未發(fā)現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞及髓腔膿液，其中A組材料與骨接觸處緊密連接，其余各組標(biāo)本外形粗大，骨質(zhì)破壞明顯，骨缺損邊緣有不規(guī)則增生及硬化，其中C組材料與骨接觸處連接不緊密，其間可見(jiàn)膿性分泌物；術(shù)后4周和8周時(shí)，每克標(biāo)本細(xì)菌計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：A、B組細(xì)菌計(jì)數(shù)明顯小于C、D組，差異有非常顯著性（P<0.01），A、B組比較，B組細(xì)菌計(jì)數(shù)小于A組，差異有顯著性（P

15、<0.05），C、D組比較，D組細(xì)菌計(jì)數(shù)小于C組，差異有顯著性（P<0.05）；組織學(xué)觀察顯示術(shù)后12周，A、B組炎癥反應(yīng)明顯較C、D組輕，B組又較A組炎癥反應(yīng)輕。
　　 成骨效果：術(shù)后12周X線顯示A組植入的填充材料與周圍骨皮質(zhì)界線模糊，與周圍骨組織基本愈合，B、C組材料與周圍骨組織未見(jiàn)明顯愈合征象；鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記顯示術(shù)后12周，A組材料與骨界面可見(jiàn)大量綠色熒光，B、C組材料邊緣及D組熒光標(biāo)記明顯較A組少；組織學(xué)觀察顯示術(shù)后

16、12周，A組膠原數(shù)量多，可見(jiàn)編織骨形成，新生骨小梁及新生血管，可見(jiàn)多數(shù)成骨細(xì)胞，成骨活動(dòng)明顯；B組無(wú)編織骨小梁，未見(jiàn)明顯膠原存在；C、D組均未見(jiàn)到骨形成，無(wú)編織骨小梁，可見(jiàn)部分膠原存在。
　　 4.2載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料動(dòng)物體內(nèi)毒副作用研究
　　 血清生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平在各時(shí)相點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩兩比較均無(wú)顯著性差異（P>0.

17、05），實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各時(shí)相點(diǎn)兩兩比較均無(wú)顯著性差異（P>0.05）；血液中Ag+濃度檢測(cè)結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組中血液中Ag+濃度均低于10ppb；組織學(xué)觀察顯示實(shí)驗(yàn)組肝腎均未見(jiàn)異常變化；術(shù)后12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肝臟、腎臟中Ag+濃度分別為（224.464±83.04）bbp和（88.57±75.72）bbp。
　　 結(jié)論：
　　 1、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料體外對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌有明顯抗菌作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌，且

18、抗菌能力隨銀離子含量的增加而加強(qiáng)；在模擬體液中有良好的緩釋效果，對(duì)L929細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)紅細(xì)胞不產(chǎn)生毒性或機(jī)械損傷，具有良好的生物相容性。
　　 2、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料對(duì)MG63成骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，對(duì)成骨樣細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及鈣離子含量均無(wú)影響，對(duì)MG63細(xì)胞具有良好的生物相容性。
　　 3、載銀納米抗菌復(fù)合骨填充材料是具有一定的抗感染能力和成骨能力的骨填充材料，其抗感染能力較載萬(wàn)古霉素骨水泥稍弱，但成