COPD人肺成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8、彈性蛋白的生成及其炎癥調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、[目的]
　　成纖維細(xì)胞是肺的重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞，并在肺組織破壞后的修復(fù)和/或重構(gòu)中起著重要作用。近年來認(rèn)為成纖維細(xì)胞也參與炎癥反應(yīng)，例如成纖維細(xì)胞在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中參與局部炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。目前關(guān)于肺成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)和修復(fù)功能關(guān)系的相關(guān)研究較少。為此，本研究擬評價慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺成纖維細(xì)胞炎癥因子水平、增殖能力和彈性蛋白合成的情況；在此基礎(chǔ)上深入探討脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、凋亡細(xì)胞、

2、壞死細(xì)胞等常見炎癥刺激對人肺成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和增殖功能的影響，并觀察低劑量茶堿的調(diào)節(jié)作用。
　　[方法]
　　(1)從因肺癌等手術(shù)切除標(biāo)本的正常肺組織中分離培養(yǎng)原代人肺成纖維細(xì)胞，建立細(xì)胞株庫，取第2、3代細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實驗和檢測。所有組織及其應(yīng)用按照倫理學(xué)要求獲取知情同意簽字后實施。根據(jù)術(shù)前肺功能將研究對象分為非COPD、COPDⅠ～Ⅲ級。通過對照研究評價COPD患者肺成纖維細(xì)胞白介素(IL)-6和IL-8的mRNA

3、和蛋白水平、增殖能力以及彈性蛋白合成。
　　(2)將人肺成纖維細(xì)胞分別和1μg/ml LPS、1ng/ml TNF-α、凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞共培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)液上清，并裂解細(xì)胞提取RNA保存?zhèn)錅y。
　　(3)在人肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中加入凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，通過多重免疫熒光染色共聚焦顯像分析肺成纖維細(xì)胞的吞噬功能。
　　(4)采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測IL-6、IL-8、組蛋白去乙?；?(HD

4、AC2)和彈性蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　(5)使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的TNF-α、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-8、IL-12p70、IL-1β以及IL-10。
　　(6)使用Fastin Elastin Assay定量檢測彈性蛋白濃度。
　　(7)用AlamarBlue()(AB)法檢測LPS、TNF-α、IL-8、IL-6以及經(jīng)LPS預(yù)處

5、理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　(8)檢測低劑量茶堿(5μg/ml)對LPS引起的肺成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8分泌、HDAC2 mRNA轉(zhuǎn)錄以及增殖能力的影響。
　　(9)用GraphPad Prism5.0 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；未通過正態(tài)分布檢驗的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(最小值，最大值)表示，其中部分增殖實驗結(jié)果以中位數(shù)(25％四分位數(shù)，75％四分位

6、數(shù))表示。根據(jù)是否正態(tài)分布以及統(tǒng)計分析類型選擇相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)方法。P<0.05為有顯著性差異。
　　[結(jié)果]
　　(1)分離得到的原代細(xì)胞在顯微鏡下具有成纖維細(xì)胞的典型形態(tài)，細(xì)胞免疫熒光染色顯示99％以上的細(xì)胞表達(dá)波形蛋白；而細(xì)胞角蛋白、von Willebrand因子、結(jié)蛋白染色陰性則證明無上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞混雜，說明原代分離的人肺成纖維細(xì)胞純度高。
　　(2)在COPD人肺成纖維細(xì)胞研究部分，根

7、據(jù)肺功能情況分為COPD s組(包括GOLDⅡ、Ⅲ級)和對照組(包括非COPD和GOLDⅠ級)，兩組在年齡、性別、吸煙史方面無顯著性差異。COPDs組(12例)和對照組(10例)FEV1占預(yù)計值％分別為(59.8±9.5)％和(92.3±8.4)％，F(xiàn)EV1/FVC％分別為(54.9±8.3)％和(73.6±10.8)％，P值均<0.001。
　　(3)qRT-PCR顯示COPDs組人肺成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄均

8、顯著高于對照組，與之相對應(yīng)的，其蛋白分泌量也明顯升高，分別為(701.6±288.0)pg/ml vs(355.7±330.8)pg/ml(P=0.02)和(754.3±297.4)pg/ml vs(373.4±243.1)pg/ml(P=0.02)。IL-6、IL-8的轉(zhuǎn)錄及分泌水平和FEV1占預(yù)計值％和FEV1/FVC％均呈負(fù)相關(guān)。
　　(4)COPDs組人肺成纖維細(xì)胞體外增殖能力弱于對照組(1.18±0.32 vs1.63±

9、0.22，P=0.004)。
　　(5)COPDs組人肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白mRNA代償性表達(dá)升高[6.194(3.118，33.000)vs2.241(0.916，22.140)，P=0.0276]，伴隨可溶性彈性蛋白升高[(26.40±6.50)μg/ml vs(15.00±3.90)μg/ml，P=0.001)]，但是不可溶性彈性蛋白無差別。
　　(6)在1μg/ml LPS刺激24h后人肺成纖維細(xì)胞分泌IL-6的水平從

10、(1156±455)pg/ml上升至(1535±439)pg/ml(P=0.0046)；IL-8從(510.5±170.6)pg/ml上升至(856.5±418.8)pg/ml(P=0.0122)；TGF-β1從(1188±623)pg/ml上升至(1773±847)pg/ml(P=0.0038)。IL-1β、TNF-α、IL-12p70、IL-10和TGF-β2基礎(chǔ)分泌較低，TGF-β3測不到；其中TGF-β2有較大幅度上升(P=0.

11、0274)，IL-1β有小幅度升高(P=0.0027)，IL-10從(37.6±17.9)pg/ml下降至(25.1±7.5)pg/ml(P=0.0382)，而TNF-α和IL-12p70則基本無改變。
　　(7)加入1ng/ml TNF-α培養(yǎng)24h后體外人肺成纖維細(xì)胞也出現(xiàn)了和LPS刺激相仿的反應(yīng)，其中以IL-8上升尤為明顯，具體表現(xiàn)為IL-6從(1066±305)pg/ml上升至(1398±466)pg/ml(P=0.035

12、8)、IL-8從(532.3±71.7)pg/ml上升至(1660.0±389.2)pg/ml(P=0.0009)、TGF-β1從(218.9±32.6)pg/ml上升至(247.9±29.4)pg/ml(P=0.0495)。
　　(8)qRT-PCR結(jié)果顯示HDAC2 mRNA在人肺成纖維細(xì)胞的相對表達(dá)量在LPS刺激后從3.546(0.511，8.886)下降至1.793(0.174，3.284)(P=0.0355)；TNF-α

13、刺激后HDAC2 mRNA表達(dá)略下降，從1.057(0.090，8.886)至0.933(0.073，2.965)，但無顯著性差異(P=0.0625)。
　　(9)人肺成纖維細(xì)胞具有吞噬周圍的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的能力，并在和凋亡細(xì)胞接觸24h后IL-6從(991.9±463.8)pg/ml上升至(1616.0±216.5)pg/ml(P<0.01)。和壞死細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，則出現(xiàn)IL-8從(371.5±57.74)pg/ml上升

14、至(740.0±204.7)pg/ml(P<0.01)；IL-1β和IL-10基礎(chǔ)分泌水平較低，前者上升，而后者有下降，P值均小于0.05。
　　(10)LPS共培養(yǎng)48h對人肺成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度和時間的增加而增加。當(dāng)濃度達(dá)到0.1μg/ml時，抑制幅度為4％左右(P=0.0306)；濃度為1μg/ml時抑制幅度約為8％(P=0.0112)；作用時間達(dá)到24h時抑制作用開始具有顯著性差異。TNF-

15、α對體外人肺成纖維細(xì)胞的增殖功能的抑制作用有劑量依賴效應(yīng)，10ng/ml時抑制程度約為10％(P=0.0241)；IL-8和IL-6具有相似效應(yīng)。經(jīng)LPS預(yù)處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細(xì)胞的增殖能力有抑制作用(P<0.05)。
　　(11)在低劑量茶堿作用研究部分，IL-6從無干預(yù)對照組的(1150±426)pg/ml上升至LPS組的(1559±406)pg/ml(P<0.001)；而茶堿+LPS組為(1336+400)p

16、g/ml，較LPS組低(P<0.05)。IL-8的趨勢和IL-6相似，空白對照組、LPS組、茶堿+LPS組分別為(560±205)pg/ml、(1087±359)pg/ml和(933±338)pg/ml。但是5μg/ml茶堿不影響細(xì)胞的HDAC2 mRNA水平，對1μg/ml LPS引起的HDAC2 mRNA下調(diào)也無作用。在0.1～10μg/ml的濃度范圍內(nèi)茶堿對人肺成纖維細(xì)胞的增殖能力無影響，而在LPS刺激的同時加入5μg/ml茶堿可

17、以改善LPS導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制(P<0.05)。
　　[結(jié)論]
　　(1)COPD患者肺成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的合成分泌上調(diào)，其水平和肺功能呈負(fù)相關(guān)；伴隨著細(xì)胞增殖功能受損以及可溶性彈性蛋白向不可溶性彈性蛋白轉(zhuǎn)化的障礙，說明人肺成纖維細(xì)胞參與COPD的炎癥反應(yīng)，同時修復(fù)功能受損。
　　(2)在受到LPS和TNF-α刺激后，體外人肺成纖維細(xì)胞出現(xiàn)以IL-6、IL-8、TGF-β1升高為特征的改變；人肺成纖維細(xì)胞能夠

18、吞噬凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并釋放不同的細(xì)胞因子，前者以IL-6分泌上升為主，而后者表現(xiàn)為IL-8、IL-1β上升、IL-10下調(diào)，這提示人肺成纖維細(xì)胞可以隨著局部環(huán)境的變化釋放不同的細(xì)胞因子從而參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。LPS引起的細(xì)胞因子釋放和HDAC2轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。
　　(3)LPS、TNF-α、IL-6、IL-8以及經(jīng)LPS預(yù)處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液對人肺成纖維細(xì)胞增殖功能有抑制作用，這說明LPS可以直接或者通過炎性細(xì)胞因子以自分泌